宋 歌 崔 熠 夏紅飛 馬 旭＊

1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院(100730);2.國(guó)家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心

砷是一種普遍存在的環(huán)境污染物[1],砷化合物對(duì)胚胎發(fā)育毒性機(jī)制的研究是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。胚胎發(fā)育是細(xì)胞和組織順次遷移和分化的過(guò)程,各種不同類(lèi)型細(xì)胞的細(xì)胞周期受到嚴(yán)格的調(diào)控,保證了各組織器官發(fā)育的協(xié)調(diào)。DNA甲基化狀態(tài)可以改變 DNA的結(jié)構(gòu),影響順式反應(yīng)元件與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,進(jìn)而影響基因的表達(dá)[2]。雞胚是一種用于研究胚胎發(fā)育過(guò)程中重要基因功能的經(jīng)典模型[3]。砷化合物對(duì)雞胚胎有十分強(qiáng)的毒性,可引起胚胎早期死亡、影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育直至引起畸形[4]。過(guò)去認(rèn)為,砷的甲基化是一種解毒方式[5]和使致癌原失活的過(guò)程,近年來(lái)的研究則認(rèn)為,砷在體內(nèi)的甲基化過(guò)程可能對(duì) DNA的甲基化造成干擾,繼而引起致癌原對(duì) DNA的損傷,所以砷的甲基化反應(yīng)被認(rèn)為是砷在體內(nèi)的毒性效應(yīng)的增強(qiáng)過(guò)程[6],目前對(duì)于無(wú)機(jī)砷致胚胎發(fā)育毒性與 DNA甲基化之間的關(guān)系尚存在很多爭(zhēng)議[7,8]。在本研究以雞胚為動(dòng)物模型,利用亞砷酸鈉(SA)誘導(dǎo)雞胚發(fā)育畸形,分析SA對(duì)雞胚基因組 DNA整體甲基化及受甲基化調(diào)節(jié)的相關(guān)基因的影響,通過(guò)補(bǔ)充甲基供體膽堿(CHO)進(jìn)一步研究 SA致雞胚發(fā)育畸形與 DNA甲基化的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 雞胚處理

所用種雞蛋為北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的白來(lái)杭 SPF級(jí)種雞蛋。為了模擬雞胚胚胎發(fā)育的過(guò)程,將雞蛋置于能自動(dòng)傾斜的空氣流通的孵箱里,孵化溫度 37.8℃,濕度為 60%。雞胚處理操作步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9],發(fā)育時(shí)期見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]。種雞蛋鈍端用打孔器打孔,用一次性無(wú)菌注射器于 Hhstage 6、8、12期分別注入 50μl生理鹽水 (CON組 ),50μl(100M)SA(SA組 ),50μl(100μg/μl)SA和 50μl(100μg/μl)膽堿聯(lián)合處理(SA+CHO組 ),50μl(100μg/μl)膽堿(CHO組)。收獲 Hhstage 20期(72h)雞胚,根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.2 雞胚生存能力檢測(cè)

雞胚生存能力間接通過(guò) 72h(Hhstage 19～20)雞胚體重和雞胚存活率來(lái)檢測(cè),收獲時(shí)以心臟跳動(dòng)為存活。獨(dú)立處理 3批,每批 25只雞胚,統(tǒng)計(jì)體重和存活率;對(duì) 72h雞胚小心剝開(kāi)蛋殼,挑取心臟跳動(dòng)的雞胚,剝離胚胎外血管網(wǎng),胚胎用 Zeiss lumar V 12立體顯微鏡在白光下攝相,觀察雞胚形態(tài)學(xué)變化。

1.3 5-甲基胞嘧啶(5-mec)免疫熒光檢測(cè)

收獲 72h雞胚置于 24孔培養(yǎng)板中,孔內(nèi)加多聚

甲醛 -20°C固定過(guò)夜。第 2天將多聚甲醛換為100%甲醇,4°C過(guò)夜。第 3天用 75%、50%、25%梯度甲醇使胚胎復(fù)水,用 PBST洗凈。10μg/ml蛋白酶K室溫通透 25min后棄去蛋白酶 K,PBST洗 1次,時(shí)間 10min。接著用含 0.1%戊二醛的 4%多聚甲醛進(jìn)行后固定,再用 PBST洗凈,加 2%山羊血清封閉 30min后加入一抗(5-mec抗體用 PBS稀釋 50倍,每孔 150μl),旋轉(zhuǎn)搖床上孵育,4℃過(guò)夜。第 4天回收一抗,PBST清洗。加入二抗(FITC標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG用 PBS稀釋 50倍),每孔 150μl。旋轉(zhuǎn)搖床上室溫孵育 2h,棄去二抗,PBST洗。胚胎用Zeiss lumar V 12立體顯微鏡 20×照相,488nm激發(fā)熒光,用 Axiovision Rel.4.8軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.4 Real-time PCR檢測(cè) bcl2、c-myc、cdkn2a、calb2基因 mRNA表達(dá)水平

1.4.1 cDNA合成 各處理組雞胚采用 Trizol試劑提取總 RNA(詳見(jiàn)試劑操作說(shuō)明),紫外分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA濃度。以總 RNA為模板,以寡核苷酸 Oligo(dT)為引物,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4.2 熒光定量 PCR 熒光定量 PCR反應(yīng)體系(20μl)如下,分別用 bcl2、c-myc、cdkn2a、calb2和內(nèi)參 GAPDH的引物 ：cDNA 1μl,引物 1μl,SYBRGreen real-time PCRMasterMix 12.5μl,ddH2O 5.5μl。用ABI 7000 real-time PCR儀分析雞胚 bcl2、c-myc、cdkn2a、calb2基因 mRNA在不同處理組中的表達(dá)情況。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃10min;95℃15s;60℃30s共 40個(gè)循環(huán)。用 7500 Software v2.0.1軟件測(cè)定每一個(gè)樣品的 Ct值(cycles threshold),用相對(duì)定量法分別分析 bcl2、c-myc、cdkn2a、calb2基因 mRNA的表達(dá)水平。以 bcl2基因?yàn)槔?具體方法如下：先計(jì)算每個(gè)樣品的ΔCt值,ΔCt=Ct(bcl2)-Ct(GAPDH);以 CON為對(duì)照,計(jì)算不同樣品與對(duì)照的ΔΔCt值,然后再用2-ΔΔCt方法計(jì)算各處理組與對(duì)照之比的 bcl2基因的相對(duì)表達(dá)量。

表 1 引物和擴(kuò)增片段大小

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 SA及其與 CHO聯(lián)合處理對(duì)雞胚生存力的影響

如表 2所示,與 CON相比,SA組胚胎存活率和胚胎體重明顯減少(P＜0.01)。AS組與 AS+CHO組相比,CHO組與 CON相比,胚胎存活率和胚胎體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組雞胚表型

由圖 1可見(jiàn),SA可誘發(fā)雞胚發(fā)育畸形,主要表現(xiàn)為體型變小、后腦發(fā)育遲緩、小頭等畸形。補(bǔ)充甲基供體 CHO,未明顯改變雞胚的發(fā)育異常。與 CON相比,單獨(dú)給予 CHO未引起胚胎發(fā)育畸形。這些結(jié)果提示補(bǔ)充膽堿不能明顯恢復(fù)胚胎的發(fā)育異常。

表 2 各組雞胚存活率及體重情況(±s)

表 2 各組雞胚存活率及體重情況(±s)

處理組 胚胎存活率 (%)(n=25)胚胎體重 (mg)(n=15)CON 98.67±2.3 19.11±1.8 SA 69.33±8.3 9.62±4.7 SA+CHO 70.66±6.1 9.27±3.4 CHO 92.00±4.0 17.86±3.7

圖1 不同處理組雞胚形態(tài)學(xué)的變化

2.3 各組雞胚基因組 DNA整體甲基化情況

圖 2 whole-mount免疫熒光檢測(cè) 5-mec基因的表達(dá)情況

5 -mec含量是基因組 DNA整體甲基化水平的體現(xiàn)。利用全胚的免疫熒光來(lái)檢測(cè)不同處理組雞胚5-mec的水平。如圖 2、圖 3所示,與 CON相比,SA組 5-mec的含量明顯減少(P＜0.01)。SA組與CHO+SA組相比,CON與 CHO組相比,5-mec的表達(dá)無(wú)顯著差異,提示補(bǔ)充 CHO不能明顯拮抗砷抑制雞胚基因組 DNA整體甲基化的作用。

2.4 不同處理方式對(duì)受甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響

為了研究雞胚整體甲基化水平改變是否影響基因的表達(dá)模式,用熒光定量 PCR來(lái)檢測(cè)受甲基化調(diào)節(jié)基因 bcl2、c-myc、cdkn2a和 calb2的表達(dá)水平。在利用 real-time PCR檢測(cè)不同處理組受甲基化調(diào)節(jié)基因的表達(dá)前,首先檢測(cè)了這些基因的溶解曲線和擴(kuò)增曲線。這些基因的溶解曲線和擴(kuò)增曲線均較特異,提示當(dāng)前反應(yīng)條件下,各基因均可得到很好的擴(kuò)增。

由圖 4可見(jiàn),與 CON相比,SA組 bcl2(P＜0.05)和 c-myc的 mRNA水平顯著降低 (P＜0.01),cdkn2a和 calb2mRNA水平?jīng)]有明顯變化(P＞0.05)。與 SA組相比,CHO+SA組 bcl-2的表達(dá)水平增加(P＜0.01),calb2的表達(dá)水平明顯減少(P＜0.05),c-myc和 cdkn2a的表達(dá)降低(P＜0.01)。CON與 CHO組 bcl2、c-myc、cdkn2a和calb2的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這些結(jié)果提示,盡管補(bǔ)充膽堿對(duì)砷抑制基因組 DNA整體甲基化水平?jīng)]有明顯的補(bǔ)償作用,但在一定程度上可以抑制部分受甲基化調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

圖 4 基因 bcl2、c-myc、cdkn2a和 calb2mRNA表達(dá)模式

3 討論

在本研究中,SA能夠顯著降低雞胚體重和存活率,并可誘發(fā)雞胚各種發(fā)育畸形,主要表現(xiàn)為體型變小、后腦發(fā)育遲緩、小頭等畸形。李勇等[11]研究了不同劑量砷誘發(fā)大鼠畸胎形成。Hood[12]給小鼠一次腹腔內(nèi)注射砷酸鈉,引起胚胎死亡,殘存仔鼠體重減輕并出現(xiàn)多種畸形,以露腦為多見(jiàn)。本研究在雞胚組織中的檢測(cè)結(jié)果與這兩篇文獻(xiàn)在大鼠和小鼠中的報(bào)道基本一致。

無(wú)機(jī)砷在環(huán)境和機(jī)體內(nèi)均有甲基化代謝的轉(zhuǎn)換過(guò)程[13],砷暴露是否引起 DNA甲基化模式的改變,進(jìn)而產(chǎn)生致畸效應(yīng),已引起人們極大的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)中,SA組雞胚基因組 DNA整體甲基化水平低于對(duì)照組,說(shuō)明砷處理組雞胚基因組 DNA整體甲基化水平降低。這與 Nohara等[14]在小鼠中的研究結(jié)果是一致的,砷能夠引起小鼠肝臟整體 DNA甲基化水平減少。此外,為了研究砷誘導(dǎo)的胚胎整體低甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系,我們選擇受甲基化調(diào)節(jié),且在砷致胚胎毒性和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用的基因 bcl2、c-myc、calb2和 cdkn2a[15,16]為研究對(duì)象,利用熒光定量 PCR分析這些基因在砷處理雞胚中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn) bcl2和 c-myc表達(dá)下調(diào),calb2和 cdkn2a沒(méi)有明顯變化,這些結(jié)果表明砷誘導(dǎo)的雞胚基因組 DNA整體甲基化水平降低,同時(shí),部分受甲基化調(diào)節(jié)的基因表達(dá)水平也具有下調(diào)趨勢(shì)。

CHO是一種含豐富甲基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),做為甲基供體參與體內(nèi)甲基代謝反應(yīng)[17]。它能夠影響胚胎發(fā)育,動(dòng)物模型研究結(jié)果和人類(lèi)流行病學(xué)研究表明,在妊娠期間補(bǔ)充 CHO對(duì)于胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能的正常是非常重要的[18]。葉酸的供甲基作用還能夠參與維持 DNA甲基化狀態(tài),影響基因的表達(dá),Ramirez等[19]報(bào)道指出葉酸能夠抵抗砷的毒性。因?yàn)槟憠A和葉酸都是一碳代謝的供體,已有研究證實(shí) CHO缺乏導(dǎo)致基因甲基化的改變,并且間接影響細(xì)胞周期調(diào)控因子 cdkn、calb2的表達(dá),以此改變胚胎大腦的發(fā)育[16];而 CHO能否拮抗砷的毒性還尚未見(jiàn)報(bào)道。為了研究 CHO是否可以拮抗砷的胚胎毒性,對(duì) SA處理的雞胚補(bǔ)充 100μg/μl CHO,觀察雞胚生存力和表型及甲基化水平的變化。研究發(fā)現(xiàn),與砷處理組相比,SA和 CHO聯(lián)合處理雞胚不能明顯改善雞胚生存力和發(fā)育情況,雞胚基因組DNA整體甲基化水平亦沒(méi)有明顯變化。檢測(cè)受甲基化調(diào)節(jié)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn) c-myc、calb2和 cdkn2a表達(dá)水平顯著降低,這些結(jié)果提示盡管補(bǔ)充 CHO對(duì)砷抑制基因組 DNA整體甲基化水平?jīng)]有明顯的補(bǔ)償作用,但可以在砷化物存在時(shí)抑制受甲基化調(diào)節(jié)的基因 c-myc、calb2和 cdkn2a表達(dá),其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

從以上結(jié)果可見(jiàn),砷通過(guò)抑制基因組 DNA整體甲基化水平引起雞胚發(fā)育異常,同時(shí),部分受甲基化調(diào)節(jié)的基因表達(dá)水平存在反向關(guān)系。甲基化供體CHO不能明顯恢復(fù)砷所致胚胎異常,但能抑制 cmyc、calb2和 cdkn2a的表達(dá)。對(duì)砷及其與 CHO聯(lián)合處理對(duì)雞胚甲基化影響分子機(jī)制的深入研究將有助于闡明基因甲基化在 SA致雞胚胚胎毒性中的作用機(jī)制。

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