李曉云，路義鑫，韓彩霞，朱江巍，宋銘忻

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

旋毛蟲?。═richinellosis）是一種重要的人獸共患寄生蟲病，主要因生食或半生食含旋毛蟲幼蟲的肉類所致。該病的流行不但對畜牧業(yè)、食品業(yè)及外貿(mào)出口造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，而且對人類健康構(gòu)成威脅［1－2］，因而及時準(zhǔn)確地診斷并治療旋毛蟲病顯得至關(guān)重要。ELISA作為一種快速的診斷方法具有方便、快捷、成本低的優(yōu)點，成為目前國內(nèi)外在疾病診斷方面最重要的方法之一，特別是在血清診斷、大規(guī)模普查以及海關(guān)的進(jìn)出口檢疫方面。旋毛蟲感染過程中排泄－分泌（excretory－secretory，ES）抗原直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要靶抗原，在旋毛蟲病的免疫病理、免疫診斷及免疫預(yù)防方面具有重要作用。ES抗原中，主要的特異性蛋白成分有3種，分子量分別為45、49ku和53ku，占 ES總量的50%以上［3－4］。本試驗利用原核表達(dá)獲得的旋毛蟲49ku ES重組抗原，初步建立了檢測血清中抗旋毛蟲排泄分泌蛋白P49抗體的間接ELISA方法，旨在為旋毛蟲新型ELISA抗體診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗用材料

1.1.1 重組抗原 純化的本地毛形線蟲（T.nativa）P49重組蛋白，表達(dá)該蛋白的菌種由本實驗室保存。

1.1.2 血清T.nativa標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血清制備方法如下：以T.nativa肌幼蟲200條感染健康昆明系小鼠，30d后眼球采血，分離血清即為旋毛蟲陽性血清，采取健康昆明系小鼠血清即為陰性血清。

1.1.3 其他材料 96孔ELISA可拆酶標(biāo)板，購自加拿大JET公司；羊抗鼠IgG－HRP和四甲基聯(lián)苯胺二酸鹽（TMB），購自Sigma公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 間接ELISA反應(yīng)參數(shù)的確定

1.2.1 重組抗原包被濃度和血清稀釋度 采用矩陣滴定法。將P49抗原以包被液（pH值9.6，0.05 mol／L碳酸鹽緩沖液）倍比稀釋，每個稀釋度1行包被96孔酶標(biāo)板，100μL／孔，4℃過夜；以PBST洗滌拍干；加封閉液200μL／孔，37℃作用2h，同法洗滌拍干；再按列加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清作矩陣滴定，每個稀釋度1列，100μL／孔，37℃保溫，同法洗滌拍干；按間接ELISA程序加入酶標(biāo)二抗，加入底物顯色，測定OD值。選擇陽性血清OD450值（P）為1.0左右，陰性血清OD450值（N）較低，且P／N比值最大所對應(yīng)的抗原、抗體稀釋度為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.2.2 封閉液和稀釋液的選擇 按1.2.1確定的參數(shù)包被抗原，分別采用50g／L脫脂乳、30g／L明膠、10g／L牛血清白蛋白（BSA）、5g／L 聚乙烯醇（PVA）作為封閉液進(jìn)行ELISA，加血清環(huán)節(jié)，分別以含0g／L、20g／L、40g／L和80g／L 濃度 PEG 6000的PBS作為稀釋液稀釋血清，按間接ELISA程序檢測。根據(jù)陰、陽性血清平均OD值，選擇最適封閉液和稀釋液。

1.2.3 血清作用時間 按上述已確立的參數(shù)包被抗原和血清，分別于37℃作用30、60、90min和120 min，按間接ELISA程序試驗，比較各組P／N值，選擇血清（一抗）作用的最佳時間。

1.2.4 酶標(biāo)二抗（羊抗鼠IgG－HRP）最佳工作條件

根據(jù)上述確定的參數(shù)包被抗原和血清，羊抗鼠IgG－HRP以稀釋液按1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000和1∶20 000稀釋，分別于37℃作用30、60、90min和120min，按間接ELISA程序操作，比較陰、陽性血清平均OD450值和P／N值，確定最適酶標(biāo)二抗工作條件。

1.2.5 最佳底物作用時間 根據(jù)上述已確立的條件，改變底物作用時間為5min、10min、15min、20 min，比較各組陰、陽性血清的平均OD450值，以確定最佳底物顯色時間。

1.2.6 間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn) 取20份陰性血清，按已確立的最適反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA檢測，按統(tǒng)計學(xué)方法計算陰性血清的平均OD450值和標(biāo)準(zhǔn)差（S），以作為臨界值。

1.3 P49－ELISA體系評價

1.3.1 重復(fù)性試驗 取10份血清樣品（陽性、陰性各5份），每份重復(fù)5孔，分別使用同一批次和不同批次包被的ELISA反應(yīng)板，進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，計算變異系數(shù)CV（%）。

1.3.2 敏感性試驗 將本地毛形線蟲（T.nativa）以5、10、15、20、25、30、35條和40條分別感染健康昆明系小鼠，每組3只。以健康鼠為對照。在感染后第1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30天于尾靜脈采血分離血清，進(jìn)行間接ELISA檢測，確定該法的敏感性。

1.3.3 交叉反應(yīng)試驗 分別檢測本實驗室保存的不同來源的旋毛蟲分離株的陽性和陰性血清，包括本地毛形線蟲、旋毛形線蟲、黑龍江豬旋毛蟲、黑龍江犬旋毛蟲、黑龍江貓旋毛蟲和美國豬旋毛蟲，觀察旋毛蟲各種株陽性血清之間交叉反應(yīng)情況。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA方法的建立

2.1.1 抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 方陣滴定結(jié)果表明，當(dāng)抗原包被濃度為4μg／mL（即稀釋度為1∶100），血清稀釋倍數(shù)為1∶100時，陽性血清OD450值（P）為1.018，陰性血清 OD450值（N）為0.088，P／N比值最大為11.568。

2.1.2 最佳封閉液和稀釋液 封閉液為5g／L聚乙烯醇（PVA），稀釋液中含PEG6000濃度為20g／L時，陽性血清OD450明顯上升，同時對陰性血清OD450影響不大，且陰、陽性血清平均OD450之比P／N最大，可見最佳封閉液為5g／L聚乙烯醇，最佳稀釋液為含20g／L PEG6000的PBS。

2.1.3 血清最佳作用時間 在37℃下血清（一抗）和已包被的抗原作用90min時，陰性血清OD值較小，陰、陽性血清平均OD450之比P／N最大。故在37℃下，血清最佳作用時間為90min。

2.1.4 酶標(biāo)二抗最佳工作條件 當(dāng)酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶10 000，37℃下作用60min時，陽性與陰性血清平均OD450之比（P／N）最大。因此酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1∶10 000，最佳作用時間為37℃60 min。

2.1.5 底物最佳顯色時間 底物作用15min時，陽性血清 OD450接近于1.0，且陰性 OD450較小，P／N比值較大，因此選擇15min作為最佳底物作用時間。

2.2 間接ELISA體系評價

2.2.1 重復(fù)性試驗結(jié)果 對10份血清樣品進(jìn)行間接ELISA檢測，批間、批內(nèi)的變異系數(shù)分別為6.84%、5.59%，均小于10%，說明建立的間接ELISA具有較好的重復(fù)性。

2.2.2 敏感性試驗結(jié)果 于第6天100%檢出感染20條／只以上的昆明系小鼠，并分別于13d 100%檢出感染15條／只、19d100%檢出感染10條／只，并在25d100%檢出感染5條／只的昆明系小鼠，即在第25天所有感染鼠血清檢出陽性?？芍腥臼笞钤鐧z出抗體陽性的時間為第6天。

2.2.3 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果 結(jié)果均為陽性，表明6個旋毛蟲種株之間具有交叉反應(yīng)，說明P49重組抗原建立的間接ELISA可用于檢測不同種株旋毛蟲感染。

3 討論

目前對旋毛蟲病的檢疫國內(nèi)常采用傳統(tǒng)的壓片鏡檢法，但其敏感性為肉中蟲體密度達(dá)到每克肌肉3條時方可檢出。雖然消化法被認(rèn)為是檢測旋毛蟲的金標(biāo)準(zhǔn)，可將蟲體檢出率提高至每克肌肉1條蟲體，但該法十分繁瑣，費時較長。Monroy等［5］用鏡檢法和人工消化法檢測539頭豬的膈肌，同時用ELISA法檢測血清樣本，結(jié)果鏡檢法和人工消化法的檢出率為0，ELISA法的檢出率為12.4%。由于ELISA法具有經(jīng)濟(jì)、敏感性和特異性高等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，國外己將ELISA法作為豬旋毛蟲病宰前的常規(guī)檢查方法。ELISA檢測的特異性和敏感性與所使用的抗原質(zhì)量有重要關(guān)系。天然ES抗原制備復(fù)雜，來源受限制，影響了ES抗原的應(yīng)用?；蛑亟M抗原具有可以大量制備、特異性好等特點，而且用量比天然ES抗原低10倍，且可排除與豬蛔蟲、豬鞭蟲的交叉反應(yīng)。因此基因重組抗原的應(yīng)用成為肉品中旋毛蟲檢疫的發(fā)展方向。

旋毛蟲49ku ES重組蛋白在旋毛蟲病檢測和預(yù)防方面具有潛在應(yīng)用價值。Western－blot分析表明，該重組蛋白P49能被鼠旋毛蟲病陽性血清特異性識別，而不與正常鼠和兔的陰性血清反應(yīng)［6－7］。本試驗建立了P49重組抗原檢測旋毛蟲抗體的間接ELISA方法，并對各項反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行摸索?？乖瓭舛群脱逑♂尪冗m宜與否會影響ELISA檢測的特異性和敏感性，通過方陣滴定確定了最佳抗原包被濃度4μg／mL和血清稀釋度1∶100。對稀釋液的優(yōu)化中，嘗試加入不同濃度PGE6000，結(jié)果表明，PGE6000濃度為20g／L時，ELISA體系P／N值最高。PGE6000通過空間排阻效應(yīng)增強抗原－抗體相互作用，這種加強作用本身是非特異性的，加大濃度延長作用時間，都會使背景值加大，且在室溫下即可進(jìn)行。間接ELISA最后的顯色也很關(guān)鍵，某一特定的ELISA檢測程序中，最佳顯色時間應(yīng)該是固定的，試驗結(jié)果表明，隨著顯色時間的延長，陰、陽性血清的OD450都會上升，室溫下顯色15min時P／N達(dá)最大，從而確定15min為最佳底物顯色時間。

建立的間接ELISA方法用于旋毛蟲感染鼠血清抗體檢測，重復(fù)性好，靈敏度高，并且交叉反應(yīng)試驗表明，可用于檢測不同種株的旋毛蟲感染，可能是因為不同種株旋毛蟲編碼P49蛋白的基因序列高度同源，只要獲得一個種株的重組P49蛋白，即可用于檢測其他不同種株的旋毛蟲感染［8］。本試驗建立的間接ELISA方法克服了壓片鏡檢和消化法費時、費力及檢出率低的不足，為研制檢測豬、犬、貓等旋毛蟲病的ELISA試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。

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