佘巍巍 陳 峰 羅 淼 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

哮喘是多種炎性細(xì)胞、炎癥介質(zhì)參與的慢性氣道炎癥性疾病，哮喘的發(fā)病機制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明。神經(jīng)生長因子(NGF)不僅作用于神經(jīng)系統(tǒng)，也影響機體免疫和造血系統(tǒng)，與變態(tài)反應(yīng)性和炎癥性疾病的發(fā)病有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)哮喘及其他許多致敏性疾病的發(fā)病可能與NGF直接相關(guān)〔1，2〕，目前已在支氣管哮喘的動物模型上證實NGF在哮喘炎癥的發(fā)生發(fā)展和維持中起著重要的作用〔3〕。本研究通過檢測各組大鼠肺組織內(nèi)NGF、嗜酸性粒細(xì)胞及TNF-α的表達(dá)量的變化，判斷NGF是否通過調(diào)節(jié)TNF表達(dá)參與哮喘發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 清潔級雌性SD大鼠，非卵蛋白飼養(yǎng)，按隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為分為對照組(A組)、哮喘組(B組)和 NGF阻斷組(C組)，每組10只。雞卵清蛋白(OVA，V級，由美國Sigma公司提供)，抗-NGF抗體(由武漢博士德生物有限公司提供)。

1.2 動物制模 A組:致敏過程以PBS代替OVA注射，激發(fā)過程以鹽水霧化吸入，相關(guān)參數(shù)與B組相同;B組哮喘模型的構(gòu)建方法于實驗第1、第14天致敏，即卵白蛋白20 μg由1 mg氫氧化鋁乳化，總體積200 μl，腹腔注射。第21～27天，將大鼠置于密閉容器內(nèi)，以超聲霧化器霧化3%OVA鹽水氣溶膠吸入激發(fā)，每天1次，每次30 min。C組哮喘模型建立同哮喘組，但于每次激發(fā)前3 h，先經(jīng)鼻滴入抗大鼠β-NGF抗體(稀釋1∶50)50 μl，每日 1 次，連續(xù) 7 d。

1.3 各組大鼠哮喘發(fā)作情況觀察與評分 最后一次激發(fā)后5 min，采用評分法比較各組動物在激發(fā)后的反應(yīng)情況:無發(fā)作者計0分;僅出現(xiàn)輕度呼吸急促，無躁動不安和發(fā)紺者計1分;明顯呼吸急促、躁動不安和發(fā)紺者計2分;呼吸極度困難，并出現(xiàn)俯伏不動、反應(yīng)遲鈍者計3分。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞計數(shù) 大鼠末次激發(fā)后24 h麻醉，結(jié)扎右肺，從氣管注入無菌磷酸鹽生理鹽水緩沖液4 ml灌洗左肺，反復(fù)6次，回收率50% ～90%，將收集到的全部支氣管肺泡灌洗液離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液置于－20℃低溫冰箱保存，高倍鏡下計數(shù)400個細(xì)胞行細(xì)胞分類計數(shù)。

1.5 支氣管肺組織病理檢測〔4〕灌洗后經(jīng)氣管向右肺注4%多聚甲醛使胸膜展平后，置4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度約5 μm，HE染色，顯微鏡下觀察支氣管肺組織病理特征。

1.6 免疫組織化學(xué) 石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理后，原位分子雜交，石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理后，按經(jīng)典方法進行原位分子雜交。陰性對照用PBS代替上述抗體。原位雜交比較三組TNF-α水平，RT-PCR半定量法測定哮喘大鼠組及正常對照組肺組織NGF mRNA表達(dá)，Western印跡法檢測三組NGF蛋白水平變化;觀察NGF、TNF-α及其mRNA在肺組織的表達(dá)，并用顯微圖像分析系統(tǒng)測定8個視野的陽性系數(shù)和灰度值。NGF、TNF-α及其mRNA陽性細(xì)胞均以胞質(zhì)著色為主，陽性顆粒呈棕褐色或棕黃色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以表示，多樣本均數(shù)比較采用F檢驗。相關(guān)性檢驗采用Pearson直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1哮喘大鼠哮喘發(fā)作分析 哮喘組大鼠發(fā)作評分與正常對照組差異顯著(P＜0.05);NGF阻斷組大鼠發(fā)作評分低于哮喘組(P＜0.05);NGF阻斷組大鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸粒細(xì)胞數(shù)明顯低于哮喘組(P＜0.05);哮喘組及NGF阻斷組大鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸粒細(xì)胞數(shù)均明顯高于正常對照組(P＜0.05)。按哮喘大鼠的發(fā)作程度行等級相關(guān)研究，隨哮喘大鼠臨床發(fā)作越重，嗜酸粒細(xì)胞數(shù)越，兩者呈正相關(guān)。

2.2 NGF蛋白及NGF-mRNA的表達(dá)與TNF-α蛋白及TNF-α mRNA的表達(dá) 哮喘組大鼠肺組織NGF蛋白、NGF mRNA的平均灰度值分別為145±7、128±7;對照組分別為189±7、191±6;抗NGF干預(yù)組分別為156±6、139±8;三組比較差異顯著(t=19.50、15.90、14.89，均 P ＜0.05);而哮喘組大鼠TNF-α 蛋白及TNF-α mRNA 的灰度值分別為141±7、127±7，對照組分別為175±8、179±9，抗NGF干預(yù)組分別為164±8、155 ±6，三組差異顯著(t=28.40、21.75、22.22，均 P ＜0.01)。各組大鼠肺組織NGF蛋白平均陽性系數(shù)為:B組＞A組，C組 ＜B組(t=1.29、3.85、2.19，均 P ＜0.05);其陽性產(chǎn)物平均灰度值(待測物質(zhì)灰度值越高，表明其在細(xì)胞中表達(dá)的量越低，反之，灰度值越低表明其在細(xì)胞中表達(dá)的量越高，下同)，其NGF mRNA平均陽性系數(shù)為:B組＜A組，C組＞B組(t=1.24、3.65、2.14，均 P ＜0.05)。各組大鼠肺組織中 TNF-α 蛋白平均陽性系數(shù)為:B組＞A組，C組＜B組(t=1.61、3.80、2.35，均P＜0.01);其 TNF-α mRNA平均灰度值為:B組 ＞A組，C組 ＜B 組(t=1.47、3.81、2.19，均 P ＜0.01)。NGF 阻斷組其肺組織TNF-α的水平低于哮喘組肺組織TNF-α的水平(P＜0.05)。NGF阻斷組其肺組織NGF的水平低于哮喘組NGF的水平(P＜0.05)。按哮喘大鼠的發(fā)作程度行等級相關(guān)研究，隨哮喘大鼠臨床發(fā)作越重，NGF水平越高，兩者正相關(guān)。

3 討論

近年的研究發(fā)現(xiàn)，NGF是神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)〔5〕，通過連接神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)而發(fā)揮放大氣道炎癥的作用。除了免疫源性機制外，氣道炎癥的神經(jīng)源性因素日益受到重視。在本研究中，哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的NGF含量與氣道炎性指標(biāo)嗜酸性粒細(xì)胞密切相關(guān)，表現(xiàn)為BALF中NGF含量越多，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤數(shù)越多。在用抗NGF抗體處理過的大鼠氣道內(nèi)，嗜酸性粒細(xì)胞明顯減少。這說明NGF促進嗜酸粒細(xì)胞在氣道內(nèi)的浸潤，說明NGF可以促進氣道炎癥發(fā)展。這與國外文獻相符〔6〕，在哮喘病人血清和BALF液中NGF的水平亦明顯升高。

本研究顯示在哮喘發(fā)病過程中，NGF參與了發(fā)病過程。與國外實驗證明哮喘狀態(tài)下NGF及其受體表達(dá)升高〔7，8〕相符，在本研究中行等級相關(guān)研究，我們進一步證實哮喘大鼠臨床發(fā)作越重，NGF水平越高，兩者呈正相關(guān)，表明檢測NGF有助于哮喘的臨床診斷和病情評估，并可能有助于判斷哮喘的發(fā)展與預(yù)后。本研究提示哮喘大鼠肺組織NGF水平高于NGF阻斷組，與國外報道一致。De-Vries等〔9〕報道給豚鼠靜脈注射NGF半小時后，便可誘發(fā)豚鼠氣道對組胺的高反應(yīng)性，氣道阻力明顯增高，而NGF本身并不引起氣道阻力的改變。若用抗NGF抗體拮抗NGF，則能消除NGF引起的氣道功能改變，以上證據(jù)表明NGF可能是連接氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的一架橋梁。

因國內(nèi)外資料〔10，11〕均已證實TNF-α對氣道炎癥具有促進作用，哮喘組大鼠血清、BALF中的TNF-α濃度較正常對照組增高，通過趨化激活中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞共同參與氣道炎癥的形成，在氣道炎癥的持續(xù)和放大中起到重要放大作用，說明其在氣道炎癥發(fā)病中具有重要意義。本實驗表明拮抗NGF生物活性則能夠有效抑制TNF-α的合成和分泌。我們判斷哮喘大鼠發(fā)作時可能系由肺組織TNF-α mRNA表達(dá)增加，TNF-α生成增多所致，阻斷內(nèi)源性NGF可降低哮喘大鼠肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)，NGF可通過調(diào)節(jié)TNF的表達(dá)而促進氣道神經(jīng)源性炎癥過程，提示NGF可能通過調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)參與哮喘發(fā)病，這從分子生物學(xué)的角度進一步說明了NGF及TNF與哮喘氣道炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，NGF可能通過增進肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)作為參與哮喘的發(fā)病機制之一。以上結(jié)果提示NGF是調(diào)控神經(jīng)源性炎癥的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，通過連接神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)揮放大氣道炎癥的作用，為進一步闡明哮喘氣道神經(jīng)源性的機制奠定基礎(chǔ)，為哮喘的預(yù)防和治療提供新的可能途徑。

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