劉 宇 劉保安 (中南大學(xué)湘雅基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410078)

胰腺癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多發(fā)生于胰頭部。腹痛及無(wú)痛性黃疸為胰頭癌的常見(jiàn)癥狀。癌腫轉(zhuǎn)移在早期即可出現(xiàn)，對(duì)于胰腺癌臨床又缺乏早期診斷的有力手段，采用手術(shù)切除方式只有10%～15%的病人在確診后可以根治性切除，況且腫瘤患者5年存活率也只有5% ～20%〔1〕。胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)于手術(shù)治療和預(yù)后是至關(guān)重要的因素。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Periostin(PN)的過(guò)表達(dá)與腫瘤的惡性程度、侵襲性和轉(zhuǎn)移性有密切關(guān)系〔2，3〕。本文將利用ELISA技術(shù)探討胰腺癌血清PN水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 試劑與設(shè)備 人PN重組蛋白、兔抗人PN mAb、兔抗人PN pcAb、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(IgG-HRP)和牛血清白蛋白(BSA)(R＆D 公司)，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(上海江萊生物科技有限公司)。雷勃MK3 Multiskan酶標(biāo)儀、THERMO Wellwash 4 MK2全自動(dòng)洗板機(jī)(Thermo公司，芬蘭)。

1.2 標(biāo)本采集 所有受試者均根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診，并分組處理，診斷依據(jù):(1)臨床表現(xiàn)為腹痛、黃疸和消瘦;(2)實(shí)驗(yàn)室檢查:①一般血清生化學(xué)檢查;②胰腺癌血清學(xué)標(biāo)記物免疫學(xué)檢查:具體包括:糖鏈抗原19-9(CA19-9)，癌胚抗原(CEA)，胰胚抗原(POA)、胰腺癌特異抗原(PaA)及胰腺癌相關(guān)抗原(PCAA)檢測(cè)指標(biāo);③影像學(xué)檢查:B超、CT、磁共振成像(MRI)進(jìn)行胰腺癌普查、篩選、診斷、確診，以供分組。檢查結(jié)果其中健康成人31例(自愿健康體檢者)，胰腺癌患者18例和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者18例，采集67例受試者的血清樣本，收集血清后，迅速離心10 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA方法

1.3.1 操作 首先采用棋盤(pán)滴定法確定最佳濃度，結(jié)果表明:在包被抗體濃度1.0 μg/ml，檢測(cè)抗體濃度1∶1 000比例時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系佳。具體操作:(1)將兔抗人PN mAb稀釋1∶1 000后，包被酶標(biāo)板，在4℃中，包被48 h，用3%BSA 進(jìn)行封閉;(2)在37℃溫度下，加入1%磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的人PN重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品使其作用1 h;(3)再加入經(jīng)1%PBS稀釋的1∶1 000 PN pcAb，4℃環(huán)境過(guò)夜，然后再放置室溫1 h;(4)加入經(jīng)1%PBS稀釋的1∶1 500羊抗兔IgG-HRP，37℃恒溫箱顯色15 ～30 min 后，讀記吸光度 A450 值〔3，4〕。

1.3.2 鑒定檢測(cè)與PN檢測(cè)分析 先以兔抗人PN mAb包被酶標(biāo)板，分別加入白介素6(IL-6)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、生長(zhǎng)激素(GH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，測(cè)定A450值并與陰性對(duì)照比較。如果PN測(cè)值為0或很低，提示血清中IL-6、VCAM-1、GH和ACTH抗原對(duì)PN的檢測(cè)影響很小，試劑盒的特異度較強(qiáng)〔4，5〕。PN ELISA 試劑盒分別測(cè)定 31例健康成人，18例胰腺癌患者和18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者的血清PN，以PN蛋白濃度為橫座標(biāo)，以A450平均值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)由分析軟件處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)靈敏度和特異性評(píng)價(jià) 取3份已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行批內(nèi)和批間變異系數(shù)分析。分析結(jié)果顯示:試劑盒的試驗(yàn)內(nèi)變異系數(shù)平均為7.6%，均小于10%;試驗(yàn)間變異系數(shù)平均為13.15%，均小于15%。在不同PN濃度的PN蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，用已建立的ELISA方法測(cè)得的回收率在82% ～92%之間，平均回收率為89.6%。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程式曲線(xiàn)擬合度R2=0.968。線(xiàn) 性 范 圍 為 4.903～500 ng/ml。靈 敏 度 為4.903 ng/ml。在加入 IL-6、VCAM-1、GH 和 ACTH 后測(cè) A450值，與陰性對(duì)照孔的A450值比較，無(wú)顯著性差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示PN蛋白與這些物質(zhì)均無(wú)交叉反應(yīng)，試劑盒的特異度較強(qiáng)。

2.2 檢測(cè)結(jié)果 健康對(duì)照者31例的血清PN含量為(22.0±6.8)ng/ml，分布呈正態(tài)，以血清濃度＜35.60 ng/ml為正常界值。18例胰腺癌患者的血清PN含量為(37.9±20.9)ng/ml，18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者的血清PN含量為(45.6±25.8)ng/ml。胰腺癌患者與健康對(duì)照者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而18例胰腺癌患者與健康對(duì)照者和18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者之間均有顯著性差異(P＜0.05)。

3 討論

PN過(guò)表達(dá)與惡性腫瘤惡性程度相關(guān)，PN與整合素結(jié)合并相互作用參與腫瘤發(fā)展，同時(shí)通過(guò)整合素和(或)EGF信號(hào)途徑促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。有研究表明，PN在促進(jìn)癌細(xì)胞生存中起重要作用，并提出了其抗體可能是有效的治療藥物的假設(shè)。PN在腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用〔6，7〕。

由于腫瘤轉(zhuǎn)移容易導(dǎo)致抗癌治療失敗和患者死亡〔8〕，而轉(zhuǎn)移相關(guān)基因被認(rèn)為是早期預(yù)測(cè)惡性腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)鍵。大量研究發(fā)現(xiàn)，PN基因就是腫瘤轉(zhuǎn)移候選基因之一，具有促進(jìn)晚期腫瘤進(jìn)展的作用;PN蛋白過(guò)表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良具有很好的相關(guān)性〔9〕。然而胰腺癌腫瘤誘導(dǎo)PN細(xì)胞因子的分子機(jī)制尚不明確，PN如何促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和生存機(jī)制也尚需進(jìn)一步研究。可是，本文實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者的PN蛋白水平明顯高于健康正常人，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者其PN蛋白水平明顯高于胰腺癌患者，這些都證實(shí)了PN與腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。因此，PN蛋白水平的檢測(cè)可以用于判斷胰腺癌和作為診斷胰腺癌是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

1 Stojadinovic A，Brooks A，Hoos A，et al.An evidence-based approach to the surgical management of resectable pancreatic adenocarcinoma〔J〕.J Am Coll Surg，2003;196(6):954-64.

2 王 強(qiáng)，傅德良.胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)實(shí)用外科雜志，2009;8:682-5.

3 賁其穩(wěn)，袁耀宗.Periostin在惡性腫瘤中的作用研究進(jìn)展〔J〕.腫瘤防治研究，2009;36(5):440-2.

4 賁其穩(wěn)，趙 縝，周 琳，等.檢測(cè)骨膜素ELISA試劑盒的制備與初步應(yīng)用〔J〕.現(xiàn)代免疫學(xué)，2009;1:64-7.

5 魏國(guó)蘭，丁 妍，韓宇翔，等.楊子義抗環(huán)瓜氨酸肽抗體定量檢測(cè)ELISA試劑盒的制備及其診斷類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的意義〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2008;21(5):421-4.

6 陳鑫磊，秦澤蓮.Periostin促進(jìn)血管形成的機(jī)制〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2011;17(2):161-3.

7 高 峰，孫治君.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C與胰腺癌淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系研究進(jìn)展〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2010;39(5):608-11.

8 樊 潔，唐 峰，李 瓊，等.胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與P53、Ki67表達(dá)及預(yù)后的關(guān)系〔J〕.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2007;14(6):825-8.

9 Siriwardena BS，Kudo Y，Ogawa I，et al.Periostin is frequently overexpressed and enhances invasion and angiogenesis in oral cancer〔J〕.Br J Cancer，2006;95(10):1396-403.