曹玲 黎萬(wàn)榮

最近研究表明耳蝸中有大量的一氧化氮合酶(nitric oxide synthease,NOS)存在[1]，提示一氧化氮(NO)在耳蝸內(nèi)有生物作用。耳蝸內(nèi)的NO與耳蝸血流調(diào)節(jié)、內(nèi)淋巴液離子穩(wěn)定性和神經(jīng)傳導(dǎo)等生理過(guò)程有關(guān)，還影響內(nèi)耳多種疾病的病理生理過(guò)程[2]。目前人們對(duì)內(nèi)耳NO及NOS的研究大多仍集中在正常生理情況下的分布和功能特征方面，而對(duì)其在內(nèi)耳病理生理與藥理?xiàng)l件下的研究報(bào)道尚少見(jiàn)，如NO是否可以通過(guò)影響耳蝸外毛細(xì)胞表面的鈣通道，從而調(diào)節(jié)外毛細(xì)胞的功能狀態(tài)，影響某些內(nèi)耳疾病的發(fā)生和發(fā)展等。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀(guān)察NO供體之一L-精氨酸(L-Arg)對(duì)豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞L型鈣通道電流(ICa-L)的影響，以探討NO能否通過(guò)耳蝸外毛細(xì)胞鈣通道途徑調(diào)節(jié)外毛細(xì)胞及內(nèi)耳的功能。

1 材料與方法

1.1耳蝸外毛細(xì)胞分離 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為40只雜色或白色豚鼠(由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重325±22 g，雌雄不拘。動(dòng)物快速斷頭處死，取出顳骨，迅速打開(kāi)聽(tīng)泡，置入已充氧的冷Hanks液中；解剖顯微鏡下仔細(xì)剔除耳蝸骨殼，盡量保持膜迷路完整；斷開(kāi)蝸軸，將耳蝸輕移入含膠原酶Ⅳ的D’Hanks液中消化10～20分鐘；輕移入含鈣的Hanks液中終止消化5分鐘；輕移入預(yù)先用多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的浴槽中，解剖顯微鏡下微鑷撕除螺旋韌帶，剪碎基底膜，輕輕吹打后靜置10分鐘，使單離的外毛細(xì)胞貼附于浴槽底部；小心更換新鮮的浴液。選擇貼壁良好、立體感強(qiáng)、表面光滑、胞核接近底部、胞內(nèi)無(wú)布朗運(yùn)動(dòng)顆粒、胞膜完整有雙折射現(xiàn)象的單離外毛細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察和實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 電極液(mM)：CsCl 119.8， MgCl24.0，EGTA 5.0，CaCl20.06，HEPES 10.0，Na2ATP 3.1， NaGTP 0.42，CsOH調(diào)pH至 7.25～7.3。浴液(mM)：NaCl 107.1，CsCl 30.0，MgCl21.8，CaCl21.8， NaHCO34.0， Glucose 5.0，Sodium pyravate 5.0，HEPES 10.0，NaH2PO4·2H2O 0.8，NaOH調(diào)pH至7.3～7.4。Hanks液(mM)：KCl 5.4，KH2PO4 0.5 ，NaCl 137.0，NaHCO34.2，Na2HPO40.3， MgCl20.5，MgSO40.4， CaCl21.3，Glucose 5.0，NaOH調(diào)pH至7.3～7.4。 D Hanks液(mM)：KCl 5.4，KH2PO4 0.5 ，NaCl 137.0，NaHCO34.2，Na2HPO40.3，NaOH調(diào)pH至7.3～7.4。鹽橋液同電極液。膠原酶Ⅳ(collagenase Ⅳ)：0.5 mg/ml以上試劑中，HEPES、EGTA、Na2ATP、NaGTP、CsOH、Sodium pyravate、膠原酶Ⅳ均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，L-精氨酸(L-Arg)：C6H14N4O2，Japan，余為國(guó)產(chǎn)分析純。

玻璃微管電極制備:選用內(nèi)徑1.0 mm、壁厚0.25 mm、長(zhǎng)度75.0 mm的軟質(zhì)毛細(xì)玻璃管 (美國(guó)Drummond scientific 公司生產(chǎn))，置于微管電極拉制儀上，經(jīng)兩步拉制而成，第一步拉制參數(shù)設(shè)置為58.4 mA，第二步拉制參數(shù)設(shè)置為53.5 mA，通過(guò)兩步拉制后的電極尖端直徑約為0.7 mm ，充灌電極液后電極阻抗約為5～8 MΩ。將拉制成的微管電極置于拋光儀垂直推進(jìn)架上，在低倍鏡(×60)下找到電極尖端和加熱電阻絲，然后換成高倍鏡(×495)，將加熱電阻絲和電極尖端調(diào)整至一個(gè)平面內(nèi)，進(jìn)行瞬間高溫加熱，待電極尖端微微回縮后，立即停止加熱，完成電極拋光。

1.3ICa-L的記錄 采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方式(AXOPA TCH-200B Axon instrument,USA)記錄不同濃度L-Arg對(duì)L型鈣通道電流的影響，根據(jù)溶液中加入的L-Arg濃度，分為0.5×10-6mol/L組(A組)、1.0×10-6mol/L組(B組)及1.5×10-6mol/L組(C組)，分別觀(guān)察各組用藥后5分鐘內(nèi) ICa-L峰值電流密度增幅。選擇鉗制電壓(VH)為-60 mV，刺激持續(xù)時(shí)間為200～300 ms的測(cè)試電壓，10 mV為一個(gè)階躍，從-50 mV除極到+50 mV，激活鈣通道，記錄ICa-L。實(shí)驗(yàn)中全細(xì)胞電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器放大后，引入記憶示波器及12位A/D、D/A轉(zhuǎn)換器，再輸入計(jì)算機(jī)用于電流信號(hào)采集，采樣頻率為20 kHz。所記錄的電流數(shù)據(jù)采用P-Clamp9.0專(zhuān)用軟件進(jìn)行分析處理，分析電流幅值(current amplitude,Am)、電流密度(current density)和電流-電壓關(guān)系曲線(xiàn)(I-V)。記錄在屏蔽防震工作臺(tái)上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1ICa-L的特性及鑒定 圖1為豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞在細(xì)胞外液游離鈣離子濃度為1.8 mmol/L和Cs+內(nèi)液時(shí)，膜片鉗全細(xì)胞記錄方式下記錄到的電流圖形。本實(shí)驗(yàn)鉗制電壓(VH)設(shè)置為-60 mV，以10 mV為一個(gè)階躍，改變指令電壓(VT)(-50 mV～+50 mV)，刺激持續(xù)時(shí)間為200～300 ms，可記錄到一電壓依賴(lài)性的內(nèi)向電流。此內(nèi)向電流的激活電壓大于-40 mV～-30 mV，激活范圍在-50 mV～+50 mv電壓范圍內(nèi)。當(dāng)VT為0 mV時(shí)電流幅值A(chǔ)m達(dá)峰值，反轉(zhuǎn)電位約為+60 mV，I-V曲線(xiàn)為鐘型。此內(nèi)向電流具有明顯的衰減現(xiàn)象，可被維拉帕米完全阻斷。以上結(jié)果均提示該內(nèi)向電流為電壓依賴(lài)性L(fǎng)型鈣通道電流。

圖1 膜片鉗全細(xì)胞記錄方式記錄到的豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞ICa-L

2.2L-Arg對(duì)耳蝸外毛細(xì)胞ICa-L的影響 VH為-60 mV、VT為0 mV時(shí)(圖2)觀(guān)察L-Arg對(duì)通道電流的影響。通道電流在L-Arg濃度為0.5×10-6mol/L ～1.5×10-6mol/L(低濃度)表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性抑制，電流幅值和峰值電流密度隨L-Arg濃度的增大而減小(圖3～5)，洗脫后通道電流部分恢復(fù)。用藥后5分鐘內(nèi)各組ICa-L峰值電流密度增幅最大值分別為：A組從3.78±1.40 pA/pF降至3.70±1.22 pA/pF，增幅為-2.12%，A組用藥前后比較，ICa-L增幅差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.35，t=1.06)；B組從3.78±1.40 pA/pF降至2.62±0.85 pA/pF，增幅為-30.69%,用藥前后比較，ICa-L增幅差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，t=6.58)；C組從3.78±1.40 pA/pF降至1.32±0.17 pA/pF， 增幅為-65.08%, 用藥前后相比，ICa-L增幅差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，t=6.35)；A與B、B與C、A與C組之間比較，ICa-L的增幅差異均有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

圖2 VH為-60 mV，VT為0 mV時(shí)浴液內(nèi)未加L-Arg時(shí)豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞ICa-L

圖3 VH為-60 mV，VT為0 mV時(shí)浴液內(nèi)加入L-Arg 0.5×10-6mol/L時(shí)豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞ICa-L

圖4 VH為-60 mV，VT為0 mV時(shí)浴液內(nèi)加入L-Arg 1.0×10-6mol/L時(shí)豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞ICa-L

圖5 VH為-60mV，VT為0mv時(shí)浴液內(nèi)加入L-Arg1.5×10-6mol/L時(shí)豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞ICa-L

圖6 L-Arg對(duì)豚鼠單個(gè)耳蝸外毛細(xì)胞ICa-LI-V曲線(xiàn)的影響

2.3L-Arg對(duì)ICa-L作用的I-V關(guān)系 在低濃度狀態(tài)下，L-Arg可使ICa-L減小，I-V曲線(xiàn)上抬(圖6)，并且隨指令電壓的變化而發(fā)生規(guī)律性的變化，在鋒電流電壓下作用最明顯，對(duì)反轉(zhuǎn)電位無(wú)明顯影響。

3 討論

在耳蝸水平，鈣通道主要是控制突觸部位神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，也可調(diào)節(jié)毛細(xì)胞中一些依賴(lài)Ca2+的細(xì)胞功能活動(dòng)，包括適應(yīng)慢收縮過(guò)程的調(diào)節(jié)。內(nèi)毛細(xì)胞的鈣通道與鉀通道互相配合，參與感受器電位的調(diào)節(jié)。前庭感受器II型毛細(xì)胞的L型鈣通道的特點(diǎn)與內(nèi)毛細(xì)胞的相似，而對(duì)耳蝸外毛細(xì)胞和前庭感受器I型毛細(xì)胞鈣通道研究資料較少。外毛細(xì)胞的L型鈣通道在膜電位去極化至-30 mV時(shí)激活，與其靜息膜電位-70 mV～-80 mV相距甚遠(yuǎn)，故生理意義尚不清楚。前庭感受器I型毛細(xì)胞L型鈣通道的生物物理特性與前庭感受器II型毛細(xì)胞的差別不大，其功能可能是參與感受器電位的調(diào)節(jié)及突觸部位遞質(zhì)的釋放。

電壓門(mén)控L型鈣通道位于內(nèi)毛細(xì)胞突觸前膜，控制鈣離子內(nèi)流和內(nèi)耳傳入突觸的遞質(zhì)釋放[3]，對(duì)聽(tīng)覺(jué)產(chǎn)生有重要意義。耳蝸內(nèi)的NO與耳蝸血流調(diào)節(jié)、內(nèi)淋巴液離子穩(wěn)定性和神經(jīng)傳遞有關(guān)。生理?xiàng)l件下，NO維持內(nèi)耳功能并與耳蝸蝸內(nèi)電位(EP)、復(fù)合動(dòng)作電位(CAP)、微音電位(CM)的產(chǎn)生有關(guān)[4]。基于L型鈣通道和NO在耳蝸外毛細(xì)胞活動(dòng)中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)研究NO供體L-Arg對(duì)ICa-L的影響，結(jié)果可見(jiàn)在全細(xì)胞膜片鉗記錄方法下，L-Arg濃度為0.5×10-6mol/L ～1.5×10-6mol/L時(shí)，對(duì)L型鈣通道電流表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性抑制，電流幅值和峰值電流密度隨L-Arg濃度的增大而減小，I-V曲線(xiàn)上抬，洗脫后通道電流部分恢復(fù)。

周建波等[5]指出，在生理?xiàng)l件下，體內(nèi)的NO對(duì)耳蝸外毛細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過(guò)阻斷外毛細(xì)胞L型鈣通道電流的內(nèi)流，從而抑制胞內(nèi)Ca2+超載來(lái)發(fā)揮作用的，這也可能是病理生理過(guò)程初期階段的一種保護(hù)機(jī)制。有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用低濃度L-Arg活體灌流耳蝸，可以部分拮抗H2O2對(duì)毛細(xì)胞的損傷[6]，也支持上述機(jī)制存在的可能性。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示低濃度L-Arg抑制ICa-L的機(jī)制與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)和既往實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[6]推測(cè)NO對(duì)L型鈣通道的影響可以通過(guò)激活鈣激活鉀通道(KCa)的負(fù)反饋機(jī)制使K+外流，促使膜向超極化方向變化，使Ca2+通道關(guān)閉，降低胞內(nèi)Ca2+水平?；谏鲜鐾茰y(cè)，NO生成過(guò)多或L型鈣通道功能異常及病理?xiàng)l件下，耳蝸內(nèi)氧自由基等代謝產(chǎn)物大量增加，可能造成外毛細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+增加，胞內(nèi)鈣超載，致細(xì)胞死亡，導(dǎo)致內(nèi)耳疾病的產(chǎn)生和發(fā)展。臨床上應(yīng)用鈣拮抗劑治療內(nèi)耳疾病有一定效果的實(shí)踐，也從另一方面支持上述機(jī)制存在的可能性[7]。

綜上所述，認(rèn)為在調(diào)節(jié)豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞的活動(dòng)中存在NO/ICa-L途徑。然而，NO在內(nèi)耳的作用可能是多方面的，其作用機(jī)理十分復(fù)雜，簡(jiǎn)單的電生理研究?jī)H能揭示NO在內(nèi)耳作用的部分機(jī)制，并不能反映其全部的生理過(guò)程。今后有待于利用其它先進(jìn)技術(shù)進(jìn)一步研究，深入探索NO與ICa-L的詳細(xì)作用機(jī)制。

(致謝：本研究實(shí)驗(yàn)部分在瀘州醫(yī)學(xué)院心肌電教研室完成，曾曉榮教授、李妙齡老師給予大力幫助，在此表示衷心的感謝！)

4 參考文獻(xiàn)

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