高明波，李興泰，阮成江

（大連民族學(xué)院a.生命科學(xué)學(xué)院;b.生物化學(xué)工程國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116605）

東北紅豆杉的愈傷組織誘導(dǎo)

高明波a，b，李興泰a，阮成江a，b

（大連民族學(xué)院a.生命科學(xué)學(xué)院;b.生物化學(xué)工程國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116605）

提取并檢測(cè)東北紅豆杉莖和葉中紫杉醇的含量，莖和葉中均含有微量紫杉醇，莖中含量稍高一些。以莖和葉為外植體，MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用10種激素配比在黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織。綜合愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)和愈傷組織傳代過(guò)程中的褐化情況，2，4－D 1.0 mg·L－1和6－BA 1.0 mg·L－1為東北紅豆杉莖愈傷誘導(dǎo)和傳代的最佳激素配比。低溫預(yù)處理外植體有利于減輕愈傷組織的褐化情況，但卻降低了愈傷組織誘導(dǎo)率。在愈傷組織及培養(yǎng)基中未檢測(cè)到紫杉醇。

東北紅豆杉;MS培養(yǎng)基;愈傷誘導(dǎo)

植物是天然化合物的寶庫(kù)，含有大量有用的次生代謝物質(zhì)，是人類藥物和工業(yè)原料的重要來(lái)源。已經(jīng)有超過(guò)10萬(wàn)種化合物從植物中分離鑒定，并且以每年大約4千種新化合物的速度增加［1］。美國(guó)醫(yī)藥市場(chǎng)的藥物有25%來(lái)自植物［2］。

紅豆杉的提取物紫杉醇（paclitaxel，Taxol?）具有獨(dú)特的抗癌機(jī)理，是繼阿霉素、順鉑以后國(guó)際市場(chǎng)最暢銷的新型抗癌藥物，對(duì)多種癌癥具有良好療效且副作用較小。紫杉醇最初從短葉紅豆杉（T.brevifolia）樹(shù)皮中提?。?］，這種樹(shù)在全世界僅有1千萬(wàn)株左右。在含量最高的樹(shù)皮中，紫杉醇的含量也僅有萬(wàn)分之幾，1公斤紫杉醇需要2 000～3 000棵短葉紅豆杉的樹(shù)皮或1萬(wàn)多公斤枝葉。紫杉醇供給問(wèn)題引起了醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，資源不足成為制約紫杉醇臨床應(yīng)用的主要因素。

目前市售的紫杉醇按原料來(lái)源不同，一般分為兩類:一類是直接從紅豆杉植物中提取;另一類為半合成紫杉醇，即從紅豆杉嫩枝條或樹(shù)葉等可再生資源中提取10－去乙酰巴卡亭Ⅲ，或用提取紫杉醇過(guò)程中的副產(chǎn)物如7－木糖紫杉醇、10－去乙酰紫杉醇、三尖杉寧堿等為原料經(jīng)化學(xué)半合成生產(chǎn)紫杉醇或多烯紫杉醇［4］。

采用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇具有很大潛力。植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的基本方法如圖1［5］。首先篩選含有目標(biāo)次生代謝物的植物及最好的基因型，選擇合適的部位作外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。在愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中篩選合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定生產(chǎn)的細(xì)胞系。然后從多個(gè)細(xì)胞系中篩選生長(zhǎng)和生產(chǎn)狀況最好的穩(wěn)定的細(xì)胞系，對(duì)之進(jìn)行生物合成途徑、誘導(dǎo)、固定化及基因修飾等方面的研究，最終在反應(yīng)器中進(jìn)行放大生產(chǎn)，以及過(guò)程工程調(diào)控。

植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是有效利用植物資源生產(chǎn)藥物的潛在技術(shù)。但產(chǎn)率偏低一直是制約該項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。要有效提高次生代謝物的產(chǎn)量，需要綜合考慮多方面的因素，有時(shí)需將多種方案綜合使用才能達(dá)到理想的效果［6－8］。首先就是外植體的選擇。不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的能力和誘導(dǎo)的愈傷組織合成次生代謝產(chǎn)物的能力均不同。選擇外植體時(shí)應(yīng)考慮到外植體部位、取材季節(jié)、器官生理狀態(tài)和發(fā)育年齡以及外植體的大小等。本實(shí)驗(yàn)即希望在紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的外植體選擇及處理環(huán)節(jié)上給出有意義的結(jié)果。

圖1 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的基本方法

1 材料與方法

1.1 材料

東北紅豆杉Taxus cuspidata在大連化物所園區(qū)內(nèi)栽培。

1.2 方法

1.2.1 東北紅豆杉莖和葉中紫杉醇的提取和檢測(cè)

取東北紅豆杉莖干粉2 g，葉干粉5 g，置于50 mL離心管中，加入8倍體積分析純甲醇（含體積比為0.01%冰醋酸），超聲提取2次，每次30 min。提取液于4 000 r·min－1下離心10 min，合并上清，25℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，定容至25 mL色譜純甲醇，0.22 μm膜過(guò)濾備做HPLC。

HPLC條件:Agilent 1100，Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相:V（乙腈）∶V （水）=52∶48，流速1 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2東北紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)

取東北紅豆杉新生莖和幼嫩葉片，按照以下程序，在誘導(dǎo)接種前進(jìn)行表面消毒:自來(lái)水反復(fù)沖洗莖和葉片3～4 h;75%乙醇浸泡莖和葉片30 s;取出莖和葉片，用無(wú)菌水浸泡5～6次，洗去表面乙醇;用0.1%升汞浸泡莖和葉片，莖泡15 min，葉片泡10 min;用無(wú)菌水將莖和葉片反復(fù)浸泡洗滌8次，洗凈表面消毒液;取出進(jìn)行過(guò)表面消毒并洗滌過(guò)的莖和葉片于滅菌后的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌剪刀將其剪成1 cm長(zhǎng)的小段（莖）或1 cm2的小塊（葉片），以備接種用。接種時(shí)，將剪好的莖和葉片貼服接種于固體培養(yǎng)基表面，每瓶培養(yǎng)基表面均勻排布4個(gè)莖段或葉片，每個(gè)激素濃度接種10瓶。

部分幼莖采摘后于4℃冰箱中保存3 d，按照以上步驟消毒接種。

東北紅豆杉莖和葉片接種于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.7%，水解乳蛋白質(zhì)量濃度為600 mg·L－1。激素配比見(jiàn)表1。

表1 東北紅豆杉愈傷誘導(dǎo)中的激素質(zhì)量濃度mg·L－1

培養(yǎng)基在高溫滅菌前均調(diào)pH=5.8，115℃高壓滅菌15 min。外植體接種后，置于黑暗條件下誘導(dǎo)，培養(yǎng)室溫度（25±2）℃。誘導(dǎo)后，每天觀察有否污染及出愈情況，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，并記錄愈傷組織的顏色、質(zhì)地及生長(zhǎng)狀況。誘導(dǎo)率計(jì)算公式為:誘導(dǎo)率=（形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/總接種外植體的塊數(shù)）×100%。

1.2.3愈傷組織繼代

愈傷組織繼代周期為30 d/代。繼代時(shí)使用無(wú)菌手術(shù)刀切下無(wú)褐化的新鮮愈傷組織，接種至新的培養(yǎng)基表面。繼代培養(yǎng)基同誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基相同。

2結(jié)果與討論

2.1 東北紅豆杉莖和葉中紫杉醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

東北紅豆杉紫杉醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù):莖為0.0081%，葉為0.006 0%。因莖和葉中均含有紫杉醇，故均被選為外植體來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織，期望獲得含有紫杉醇的愈傷組織進(jìn)而建立液體懸浮細(xì)胞系。

2.2 東北紅豆杉不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率比較

東北紅豆杉不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況見(jiàn)表2。

表2 東北紅豆杉不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率%

葉子在10種培養(yǎng)基上均基本沒(méi)有愈傷產(chǎn)生。莖在10種培養(yǎng)基上均有較高的誘導(dǎo)率，總誘導(dǎo)率為90.9%，低溫處理并沒(méi)有提高其誘導(dǎo)率，而是有一定程度的降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道有所不同。

2.3 東北紅豆杉不同激素處理莖愈傷組織誘導(dǎo)率比較

東北紅豆杉不同激素處理莖愈傷組織誘導(dǎo)情況見(jiàn)表3。

表3 東北紅豆杉不同激素處理莖愈傷組織誘導(dǎo)率%

本試驗(yàn)中，2，4－D 2.0 mg·L－1，KT 0.1 mg·L－1系以東北紅豆杉莖為外植體誘導(dǎo)愈傷組織最佳的激素配比，莖直接誘導(dǎo)和經(jīng)低溫處理3 d后誘導(dǎo)的誘導(dǎo)率均達(dá)100%，愈傷生長(zhǎng)情況分別如圖2、圖3。其次依次為2，4－D 1.0 mg·L－1，6－BA 1.0 mg·L－1;2，4－D 1.0 mg·L－1，KT 1.0 mg·L－1。對(duì)于莖愈傷的誘導(dǎo)，最不適合的激素配比為2，4－D 1.0 mg·L－1，6－BA 2.0 mg·L－1，其次為2，4－D 1.0 mg·L－1，KT 1.0 mg·L－1。

愈傷誘導(dǎo)中，有兩個(gè)值得注意的現(xiàn)象:粗的莖、較細(xì)的莖出愈早且長(zhǎng)得好;低溫處理的莖誘導(dǎo)出的愈傷較直接由莖誘導(dǎo)的愈傷褐化程度低。

圖2 東北紅豆杉莖直接誘導(dǎo)得到的愈傷組織（培養(yǎng)基為MS+2，4－D 2.0 mg·L－1，KT 0.1 mg·L－1）

圖3 東北紅豆杉莖經(jīng)低溫處理后誘導(dǎo)得到的愈傷組織（培養(yǎng)基為MS+2，4－D 2.0 mg·L－1，KT 0.1 mg·L－1）

2.4 東北紅豆杉愈傷傳代

傳代時(shí)，愈傷集中接種到新培養(yǎng)基中央較分散傳代長(zhǎng)得更快，有新嫩黃愈傷長(zhǎng)出。傳代后的愈傷組織生長(zhǎng)狀況如圖4。但愈傷整體上生長(zhǎng)緩慢，容易褐化。2，4－D 2.0mg·L－1，KT 0.1 mg·L－1雖然是誘導(dǎo)莖產(chǎn)生愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，但愈傷傳代過(guò)程中出現(xiàn)明顯褐化。比較愈傷誘導(dǎo)和傳代過(guò)程中褐化情況，2，4－D 1.0 mg·L－1，6－BA 1.0 mg·L－1為誘導(dǎo)莖產(chǎn)生愈傷組織及愈傷組織傳代的最佳培養(yǎng)基。

2.5 愈傷組織及培養(yǎng)基中紫杉醇的檢測(cè)

按照1.2.1的方法提取檢測(cè)愈傷組織及其培養(yǎng)基中的紫杉醇，沒(méi)有檢測(cè)到紫杉醇，只檢測(cè)到紫杉烷。這說(shuō)明雖然活體時(shí)紅豆杉莖中含有微量紫杉醇，但經(jīng)離體培養(yǎng)后其體內(nèi)的生物合成代謝途徑發(fā)生了變化，不再生產(chǎn)紫杉醇。其中的機(jī)理留待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

圖4 東北紅豆杉愈傷組織傳代后生長(zhǎng)狀況（培養(yǎng)基為MS+2，4－D 1.0 mg·L－1，6－BA 1.0 mg·L－1）

3 結(jié)論

2，4 －D 1.0 mg·L－1和6－BA 1.0mg·L－1為東北紅豆杉莖愈傷誘導(dǎo)和傳代的最佳激素配比。低溫預(yù)處理外植體可以減輕愈傷組織的褐化，但卻降低了愈傷組織誘導(dǎo)率。在東北紅豆杉愈傷組織及其培養(yǎng)基中均未檢測(cè)到紫杉醇，說(shuō)明外植體在活體和離體情況下次生代謝活動(dòng)有所不同，內(nèi)在原因需進(jìn)一步探索。

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Calli Induction of Taxus Cuspidata

GAO Ming－boa，b，LI Xing－taia，RUAN Cheng－jianga，b
（a.College of Life Science;b.Key Laboratory of Biochemical Engineering（SEAC－ME），Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

Taxol of stems and leaves of Taxus cuspidata has been extracted and determined，which shows that both stems and leaves contain trace taxol，while the content of stems is a little higher than that of leaves.Taken stems and leaves as explants，and taken MS basal media as media，ten kinds of hormone combinations have been applied to induce calli in dark.According to the calli inductivity，calli vegetative state，and browning degree during the calli subculture，2，4－D 1.0 mg·L－1and 6－BA 1.0 mg·L－1are the best hormone combination to induce and subculture calli from stems of T.cuspidata.Low temperature pretreatment is good to alleviate browning of calli，while reduces the calli inductivity.Taxol is not detected in the calli and media.

Taxus cuspidata;MS media;calli induction

Q813.11

A

1009－315X（2011）03－0256－04

2010－12－07;最后

2011－03－01

大連民族學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（2009A202）。

高明波（1974－），女，山東萊陽(yáng)人，講師，博士，主要從事植物細(xì)胞工程研究。

（責(zé)任編輯 鄒永紅）