沈汪洋，金征宇

(1.武漢工業(yè)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122)

α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase，α-Gal;EC 3.2.1.22)是一種外切糖苷酶，可以分解蜜二糖，又稱(chēng)為蜜二糖酶。此酶主要水解以具有α-半乳糖苷結(jié)構(gòu)的碳水化合物，因此又將蜜二糖酶命名為α-半乳糖苷酶［1］。α-半乳糖苷酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中［2］?？Х榷功?半乳糖苷酶是從咖啡豆中提取得到的一種α-半乳糖苷酶。由于此酶具有三項(xiàng)顯著功能而受到研究者的重視：制備環(huán)糊精衍生物［3］，法布里病的臨床治療［4］，血型轉(zhuǎn)換研究(B 型血轉(zhuǎn)換成O型血)研究［5］。但是利用傳統(tǒng)的方法，從咖啡豆中獲得α-Gal不能滿(mǎn)足目前的研究需求，酶活較低，成為此酶進(jìn)一步應(yīng)用的瓶頸。2005年，Marraccini等［6］報(bào)道在發(fā)芽咖啡豆中發(fā)現(xiàn) α-Gal的酶活普遍高于咖啡豆(綠咖啡豆)來(lái)源的α-Gal酶活。本實(shí)驗(yàn)追蹤國(guó)外報(bào)道，在從發(fā)芽咖啡豆中提取、分離、純化得到α-Gal的基礎(chǔ)上，深入研究α-Gal的化學(xué)修飾，找出該酶的活性中心所需的氨基酸種類(lèi)和數(shù)目，為此酶的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑

發(fā)芽咖啡豆α-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)室自制［7］;對(duì)硝基苯酚-α-半乳糖苷，碳二亞胺，丁二酮，Sigma公司;焦碳酸二乙酯，對(duì)氯汞苯甲酸，二硫蘇糖醇，二硫硝基苯甲酸，Amresco公司;N-溴代琥珀酰亞胺，三硝基苯酚，國(guó)藥集團(tuán);其余試劑均為常規(guī)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HT多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek公司;Direct-Q3超純水系統(tǒng)：美國(guó) Millipore公司;Delta320 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋：金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-Gal酶活和蛋白測(cè)定

酶活測(cè)定參照Marraccini的方法［6］。蛋白質(zhì)含量采用Bradford法［8］測(cè)定。

1.3.2 α-Gal的化學(xué)修飾

選用幾種蛋白質(zhì)側(cè)鏈修飾劑對(duì)發(fā)芽咖啡豆α-Gal進(jìn)行化學(xué)修飾，將蛋白質(zhì)側(cè)鏈修飾劑分別與0.05mL α-Gal(0.1mg/mL)酶液等量混合，達(dá)到各自所需的修飾濃度，在26℃下保溫30min，然后測(cè)定發(fā)芽咖啡豆α-Gal的殘余酶活。以各修飾劑的緩沖液代替修飾劑，在同樣條件下測(cè)定發(fā)芽咖啡豆α-Gal的酶活，以此酶活作為各自對(duì)應(yīng)修飾的發(fā)芽咖啡豆α-Gal酶活的100%［9-11］。

1.3.3 色氨酸殘基數(shù)的測(cè)定

用N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)修飾發(fā)芽咖啡豆α-Gal，氧化的色氨酸殘基數(shù)按Spande等人［12］的方法測(cè)定。將發(fā)芽咖啡豆α-Gal用pH4.0的0.1mol/L醋酸緩沖液稀釋?zhuān)考尤隢BS溶液，使其濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，在25℃下保溫30 min，測(cè)定280 nm處的光吸收值的下降值(ΔA280nm)，當(dāng)ΔA280nm不再變動(dòng)時(shí)，表明修飾已完成，即可定量計(jì)算被修飾的色氨酸殘基數(shù)(以不加NBS的發(fā)芽咖啡豆α-Gal酶液作為對(duì)照)。計(jì)算方法如下：

式中，n為每摩爾酶中被NBS氧化的色氨酸殘基摩爾數(shù)，ΔA280nm為對(duì)照酶液在280 nm處的吸光度與NBS氧化后的酶液在相同波長(zhǎng)下的吸光度差值，W為酶的重量，1.31為Witkop因數(shù)，5500為色氨酸在280nm處的摩爾消光系數(shù)，Mr為酶的分子量，V為酶溶液的體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾劑的反應(yīng)條件

在設(shè)計(jì)化學(xué)修飾反應(yīng)時(shí)，仔細(xì)選擇反應(yīng)條件是很關(guān)鍵的一步。結(jié)合一些參考文獻(xiàn)的報(bào)道，選擇幾種化學(xué)修飾劑修飾發(fā)芽咖啡豆α-Gal。表1列出了各種化學(xué)劑及其修飾反應(yīng)的條件。

表1 化學(xué)修飾反應(yīng)的條件

2.2 α-Gal的化學(xué)修飾結(jié)果

七種化學(xué)修飾劑對(duì)發(fā)芽咖啡豆α-Gal的化學(xué)修飾結(jié)果如表2所示。

表2 α-Gal的化學(xué)修飾

當(dāng)NBS的濃度為0.1 mmol/L時(shí)，α-Gal完全失活，說(shuō)明色氨酸(Trp)是α-Gal活性中心的必需氨基酸。PCMB濃度為0.5 mmol/L時(shí)，α-Gal的活力只剩余15.2%。EDC濃度為1mmol/L時(shí)，α-Gal的活力只剩余41.5%。濃度為1mmol/L時(shí)，α-Gal的剩余酶活為57.8%。說(shuō)明巰基(-SH)、羧基(-COOH)和組氨酸(His)可能是發(fā)芽咖啡豆α-Gal活性中心的組成部分。DIC、TNBS和DTT對(duì)α-Gal的活力影響很小，說(shuō)明精氨酸(Arg)、賴(lài)氨酸(Lys)和-S-S-不是維持發(fā)α-Gal酶活的必需基團(tuán)。

2.3 組氨酸殘基的化學(xué)修飾

在相同的α-Gal溶液中分別加入不同量的焦碳酸二乙酯(DEPC)，測(cè)定α-Gal的殘余活力，結(jié)果如圖1所示。隨著DEPC濃度的增大，α-Gal的活力逐漸下降，并趨向于一個(gè)穩(wěn)定的值。當(dāng)DEPC濃度為1.0 mmol/L 時(shí)，α-Gal殘余酶活只有 57.8%，說(shuō)明His可能是活性中心的組成部分，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 DEPC對(duì)α-Gal的修飾

2.4 羧基氨基酸殘基的化學(xué)修飾

加入不同量的水溶性的碳二亞胺(EDC)對(duì)發(fā)芽咖啡豆α-Gal活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2所示。隨著EDC濃度的增大，α-Gal活力逐漸下降，當(dāng)EDC濃度達(dá)到 1.0 mmol/L時(shí)，α-Gal殘余活力降至41.5%。表明發(fā)芽咖啡豆α-Gal活性中心的必需氨基酸可能含有-COOH氨基酸-谷氨酸(Glu)或天門(mén)冬氨酸(Asp)。

圖2 EDC對(duì)α-Gal的修飾

2.5 巰基的化學(xué)修飾

將不同量的對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)加入到發(fā)芽咖啡豆 α-Gal溶液中，使其濃度分別為 0.1，0.2，0.3，0.4 和 0.5mmol/L，在26℃下保溫 30min，然后測(cè)定殘余酶活，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中看出，隨著PCMB濃度的增加，α-Gal活力逐漸下降。當(dāng)PCMB濃度為0.1 mmol/L時(shí)，α-Gal殘余活力快速降至35.1%，說(shuō)明-SH的修飾對(duì)α-Gal的酶活是十分敏感的。當(dāng)PCMB濃度增加，達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)，α-Gal殘余活力已經(jīng)降至15.2%。表明-SH是維持α-Gal活性必須的基團(tuán)。

圖3 PCMB對(duì)α-Gal的修飾

2.6 色氨酸殘基的化學(xué)修飾

在酸性條件下，NBS能夠選擇性地修飾蛋白質(zhì)中的 Trp 殘基［13-14］。

(1)色氨酸殘基總數(shù)的測(cè)定

向酶液中加入8mol/L的尿素，加熱煮沸5min，置于透析袋中透析，除去尿素。測(cè)定酶活，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)不出酶活，說(shuō)明α-Gal已經(jīng)完全變性。再用不同量的NBS(4mmol/L)修飾，測(cè)其280 nm處的吸光值，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)A280nm的下降數(shù)值計(jì)算被氧化修飾的 Trp殘基數(shù)［15］。

圖4 NBS對(duì)吸光度的影響

當(dāng)加入80 μLNBS時(shí)，A280達(dá)到最低值，繼續(xù)加入，A280有所回升，說(shuō)明Trp殘基已全部被修飾。計(jì)算A280達(dá)到最低值時(shí)和未添加NBS時(shí)的α-Gal酶液的吸光值的差值，得到ΔA280nm。帶入公式計(jì)算，發(fā)現(xiàn)NBS共修飾了15個(gè)Trp殘基。由于尿素使α-Gal變性后分子內(nèi)部氨基酸完全暴露，可全部被修飾，所以發(fā)芽咖啡豆α-Gal分子中共有15個(gè)色氨酸殘基。

(2)色氨酸殘基的修飾與酶活力的定量關(guān)系

采用鄒氏作圖法研究酶的修飾與酶活力的定量關(guān)系，該方法已成為化學(xué)修飾定量處理的主要方法［16］。用不同量的NBS修飾發(fā)芽咖啡豆α-Gal，同時(shí)測(cè)定其酶活，以不加NBS的酶液酶活為100%。

其測(cè)定結(jié)果按照下式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理：

圖5 α-Gal殘余活力分?jǐn)?shù)與被修飾色氨酸殘基殘余分?jǐn)?shù)的關(guān)系

式中：a是活力剩余分?jǐn)?shù);x是Trp殘基的剩余分?jǐn)?shù);n是Trp殘基的總數(shù);s是反應(yīng)最快的非必需基團(tuán)數(shù);p是反應(yīng)較快的基團(tuán)數(shù)，其中包括i個(gè)必需基團(tuán)。

利用鄒氏作圖法處理數(shù)據(jù)［10］，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)i取值為1時(shí)，以a1/i對(duì)x作圖基本符合直線(xiàn)關(guān)系，得到較好的擬合。當(dāng)i取值為2時(shí)，以a1/i對(duì)x作圖不符合直線(xiàn)關(guān)系。根據(jù)鄒氏作圖法的原理，取符合直線(xiàn)擬合的數(shù)據(jù)來(lái)反映酶殘余活力分?jǐn)?shù)與被修飾Trp殘基殘余分?jǐn)?shù)的關(guān)系。

當(dāng)i=1時(shí)，將符合直線(xiàn)關(guān)系的數(shù)據(jù)作圖，以α-Gal殘余活力分?jǐn)?shù)a為縱坐標(biāo)，以被修飾色氨酸殘基殘余分?jǐn)?shù)x為橫坐標(biāo)。得到的直線(xiàn)如圖6所示。

圖6 α-Gal殘余活力分?jǐn)?shù)與被修飾色氨酸殘基殘余分?jǐn)?shù)的關(guān)系

從直線(xiàn)關(guān)系得到：n/p=7.4118;(n-p-s)/p=4.9224。α-Gal中 Trp殘基總數(shù)為 15，經(jīng)計(jì)算，p值約為2;s值約為3。這說(shuō)明在發(fā)芽咖啡豆α-Gal的15個(gè)色氨酸殘基中，有3個(gè)反應(yīng)最快的酶活性非必需基團(tuán);2個(gè)反應(yīng)較快的基團(tuán)，其中1個(gè)為酶活性必需基團(tuán);還有10個(gè)反應(yīng)最慢或根本不反應(yīng)的基團(tuán)。

3 結(jié)束語(yǔ)

在一定濃度條件下，化學(xué)修飾劑對(duì)發(fā)芽咖啡豆α-Gal的化學(xué)修飾結(jié)果顯示：色氨酸是α-Gal活性中心的必需氨基酸，-SH、-COOH和組氨酸對(duì)α-Gal的活性有影響，精氨酸、賴(lài)氨酸和-S-S-不是α-Gal的必需基團(tuán)。

鄒氏作圖法顯示發(fā)芽咖啡豆α-Gal中色氨酸殘基總數(shù)為15，其中有3個(gè)反應(yīng)最快的酶活性非必需基團(tuán);2個(gè)反應(yīng)較快的基團(tuán)，其中1個(gè)為酶活性必需基團(tuán);還有10個(gè)反應(yīng)最慢或根本不反應(yīng)的基團(tuán)。

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