孔 靜,王昭萍**,于瑞海,張躍環(huán),劉 劍,李曉瑜,李雅琳,郭希明

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003;2.青島嶗東海珍品良種培育有限公司,山東青島266105;3.Haskin Shellfish Research Laboratory,Institute of Marine and Coastal Sciences,Rutgers University,Port Norris,New Jersey 08349 USA)

貝類多倍體[1]的誘導(dǎo)主要是研究貝類三倍體。三倍體較二倍體具有絕對(duì)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),個(gè)體大且繁殖季節(jié)死亡率低。又因其性腺高度不育,在繁殖季節(jié),仍具有豐富的糖原,口感好,很受消費(fèi)者喜歡,具很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。三倍體貝類比正常貝類個(gè)體多一套染色體,不會(huì)對(duì)自然群體造成物種污染,既提高了貝類產(chǎn)量,增加經(jīng)濟(jì)價(jià)值,又為海產(chǎn)貝類育種提供了新的育種概念等,均是三倍體貝類的研究的重要原因。

以往研究從理化誘導(dǎo)和生物方法均獲得過(guò)貝類三倍體。就牡蠣多倍體的誘導(dǎo)而言,最先采用的就是化學(xué)誘導(dǎo)方法,Stanley等[3]最早采用不同濃度的細(xì)胞松弛素B處理美洲牡蠣(Crassostrea virginica)受精卵,得到8個(gè)月三倍體子代。之后長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)[4-7]、食用牡蠣(Ostrea edulis)[8]、悉尼巖牡蠣(Saccostrea commercialis)[9]和僧帽牡蠣(O.cucullata)[10]等牡蠣也成功誘導(dǎo)出三倍體。因理化誘導(dǎo)極易受外界因子如溫度、密度等的影響,三倍體誘導(dǎo)率無(wú)法達(dá)到100%,但生物雜交方法通過(guò)四倍體牡蠣和二倍體牡蠣雜交,可產(chǎn)生全三倍體牡蠣[11],前景較好[12]。

以往研究證明了雜交獲得三倍體的誘導(dǎo)率高,方法簡(jiǎn)單,避免理化誘導(dǎo)對(duì)受精卵造成的影響,提高了孵化率和變態(tài)率[13],也初步證實(shí)了三倍體牡蠣的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[11,24]。但如何利用不同地域的二倍體群體進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn),進(jìn)一步證實(shí)和提高雜交三倍體性狀,研究不多。本實(shí)驗(yàn)利用中國(guó)太平洋牡蠣自交、誘導(dǎo)及中國(guó)二倍體太平洋牡蠣與美國(guó)四倍體太平洋牡蠣雜交,對(duì)誘導(dǎo)獲得的三倍體群體及雜交獲得的三倍體,進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育比較來(lái)評(píng)估2種獲得三倍體的方法,為三倍體誘導(dǎo)方法的選擇及其今后的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 親貝的來(lái)源與促熟

中國(guó)太平洋牡蠣取自威海文登海區(qū)。美國(guó)四倍體太平洋牡蠣(雄)來(lái)自美國(guó)華盛頓州。親貝在嶗東海珍品培育有限公司育苗池網(wǎng)箱中暫養(yǎng)促熟。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案 本試驗(yàn)采用3個(gè)試驗(yàn)組,分別為2NC、3NC、3N H;其中,2NC二倍體對(duì)照組:中國(guó)二倍體太平洋牡蠣自交組;3NC誘導(dǎo)三倍體群體組:中國(guó)二倍體太平洋牡蠣(2NC)雌♀×中國(guó)二倍體太平洋牡蠣(2NC)雄♂,再經(jīng)150μmol/L的6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)抑制受精卵第二極體的排放;3NH雜交三倍體組:中國(guó)二倍體太平洋牡蠣(2NC)雌♀×美國(guó)四倍體太平洋牡蠣(用4NA表示)雄♂。

1.2.2 受精 取性腺少量細(xì)胞,顯微鏡下鑒別雌雄,并檢查精卵的成熟狀況。雌雄牡蠣嚴(yán)格分開(kāi),以免精子污染。用解剖刀逐個(gè)刮取成熟性腺部,將卵用250目篩絹過(guò)濾后至標(biāo)記好的小桶中熟化1 h,舍棄上層卵液。受精前檢查卵子是否已經(jīng)受精,將獲得的精、卵按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組合受精,迅速混合,攪拌均勻,于孵化桶中孵化。整個(gè)操作過(guò)程中,各實(shí)驗(yàn)組嚴(yán)格隔離,使其不受外來(lái)精、卵的影響。

1.3 幼蟲(chóng)及稚貝的培育

受精卵經(jīng)24 h發(fā)育為D形幼蟲(chóng)。選優(yōu)后,幼蟲(chóng)培育密度設(shè)為8～10個(gè)/mL,培育水溫21℃,餌料每天投喂3次,前期為金藻,后期為扁藻與小球藻(1∶1)混合投喂。每天全量換水,為防止不同實(shí)驗(yàn)組幼蟲(chóng)之間混雜,換水網(wǎng)箱單獨(dú)使用。定期調(diào)整密度,消除養(yǎng)殖密度對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響。

1.4 數(shù)據(jù)測(cè)量

(1)分別測(cè)量各組卵徑、卵裂率、D幼率和D形幼蟲(chóng)大小。

(2)生長(zhǎng)用殼高、殼長(zhǎng)衡量。幼蟲(chóng)階段每3 d測(cè)量1次;稚貝階段在40、70、110和140日齡測(cè)量。每次測(cè)量設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)隨機(jī)測(cè)量30個(gè)個(gè)體。(3)測(cè)定浮游期各試驗(yàn)組幼蟲(chóng)的存活率。

(4)測(cè)定各試驗(yàn)組倍性。幼蟲(chóng)期取D形幼蟲(chóng)以及在稚貝期取個(gè)體鰓組織,收集到1.5 m L離心管中,加入DAPI熒光染液1 m L,振蕩器震蕩0.5 min,用Partec PAⅡ流式細(xì)胞儀(FCM)進(jìn)行倍性檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel作圖,SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理,不同試驗(yàn)組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析方法,差異顯著性設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 卵徑、卵裂率、D幼率、D形幼蟲(chóng)大小及倍性

試驗(yàn)各組的卵徑、卵裂率、D幼率、D形幼蟲(chóng)大小及三倍體誘導(dǎo)率見(jiàn)表1。3個(gè)試驗(yàn)組在卵徑和卵裂率方面均無(wú)顯著性差異(P>0.05),雜交三倍體的D形幼蟲(chóng)規(guī)格顯著大于誘導(dǎo)群體組和二倍體自交組(P<0.05)。但在D幼率上看,3N H組個(gè)體顯著高于3NC群體組(P<0.05),與對(duì)照二倍體組無(wú)顯著差異(P>0.05)。在三倍體誘導(dǎo)率方面,雜交獲得的三倍體率為100%,明顯高于誘導(dǎo)群體組獲得的三倍體倍化率。

表1 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體卵徑、卵裂率、D幼率、D形幼蟲(chóng)大小及倍性測(cè)定的比較Table 1 Comparison of egg-diameter,cleavage rate,hatching rate,D larval size and ploidy for trip loid Pacific oyster by hybridized and induced

2.2 浮游期幼蟲(chóng)存活率

圖1 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體幼蟲(chóng)存活比較Fig.1 Survival rates of trip loid Pacific oysters by hybridized and induced

將D形幼蟲(chóng)的存活率定義為100%,由各試驗(yàn)組存活曲線(見(jiàn)圖1)可以看出,隨著幼蟲(chóng)日齡的增長(zhǎng),各組幼蟲(chóng)的存活率下降,且各試驗(yàn)組的存活率變化不同。3日齡時(shí),2NC和3N H組存活率彼此間無(wú)顯著差異(P>0.05),但顯著高于3NC群體(P<0.05);6～15日齡期間,各試驗(yàn)組的幼蟲(chóng)存活率順次為3NH>2NC>3NC群體,且各組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 雜交三倍體與誘導(dǎo)三倍體群體生長(zhǎng)比較

2.3.1 幼蟲(chóng)的生長(zhǎng) 各試驗(yàn)組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)曲線如圖2。3組的殼高生長(zhǎng)速度分別為2NC組(13.73±0.98)μm/d,3NC群體組(15.80±0.83)μm/d和3NH組(16.41±0.61)μm/d。9日齡以前,各試驗(yàn)組幼蟲(chóng)的大小彼此間無(wú)顯著差異;9～18日齡期間,3NH組殼高生長(zhǎng)速度最快,表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。整個(gè)幼蟲(chóng)浮游期間,從幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)速度上看:3NH組>3NC群體組>2NC組,且3組間差異均顯著(P<0.05)。

圖2 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體幼蟲(chóng)生長(zhǎng)比較Fig.2 Shell height of trip loid Pacific oysters by hybridized and induced

圖3 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體稚貝殼高的生長(zhǎng)比較Fig.3 Shell height of juvenile of triploid Pacific oysters by hybridized and induced

圖4 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體稚貝殼長(zhǎng)的生長(zhǎng)比較Fig.4 Shell length of juvenile of triploid Pacific oysters by hybridized and induced

2.3.2 稚貝的生長(zhǎng) 各試驗(yàn)組稚貝期殼高和殼長(zhǎng)的生長(zhǎng)曲線如圖3、4。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),3組殼長(zhǎng)和殼高均保持相同的增長(zhǎng)趨勢(shì)。稚貝期3組的殼高生長(zhǎng)速度分別是2NC組(0.151±0.025)mm/d,3NC群體組(0.179±0.028)mm/d和3NH組(0.230±0.065)mm/d;殼長(zhǎng)的生長(zhǎng)速度分別是2NC組(0.099±0.010)mm/d,3NC群體組(0.110±0.016)mm/d和3NH組(0.132±0.031)mm/d。稚貝期各試驗(yàn)組殼高、殼長(zhǎng)的生長(zhǎng)速度:3NH>3NC群體>2NC,且彼此間的生長(zhǎng)速度差異顯著(P<0.05)。

2.4 稚貝期三倍體群體中二倍體和三倍體與雜交三倍體生長(zhǎng)比較

在稚貝期(110日齡)對(duì)誘導(dǎo)三倍體群進(jìn)行了倍性檢測(cè),并對(duì)分離出的三倍體和二倍體以及雜交三倍體進(jìn)行了生長(zhǎng)測(cè)量,殼高和殼長(zhǎng)的生長(zhǎng)情況如表2。結(jié)果表明,到110日齡的稚貝期,誘導(dǎo)群體中的三倍體在殼高和殼長(zhǎng)2方面稍小于雜交三倍體,但無(wú)明顯差異(P>0.05),而誘導(dǎo)群體中的二倍體則比二倍體對(duì)照組生長(zhǎng)快,尤其殼高明顯大于對(duì)照組。

表2 稚貝期(110日齡)三倍體群體中二倍體和三倍體與雜交三倍體生長(zhǎng)性狀比較Table 2 Comparison of shell length and shell height of juvenile of dip loid and trip loid Pacific oyster by hybridized and induced(Day 110)/mm

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所選6-二甲氨基嘌呤誘導(dǎo)三倍體的方法是因?yàn)?-二甲氨基嘌呤作為誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)率高,毒性小,操作方便,價(jià)格便宜[14],現(xiàn)已被廣泛采用。

雜交、誘導(dǎo)2種方法獲得的三倍體卵裂率高,生長(zhǎng)速度快,D形幼蟲(chóng)大小均大于二倍體對(duì)照組,但D形幼蟲(chóng)率很低。尤其是誘導(dǎo)獲得的三倍體群體組D形幼蟲(chóng)率低,由于6-DMAP的影響,使得牡蠣幼蟲(chóng)出現(xiàn)畸形,該組死亡率在前期迅速下降。但雜交三倍體組存活率很穩(wěn)定。應(yīng)與化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)受精卵產(chǎn)生的影響有關(guān),這與田傳遠(yuǎn)等[15]結(jié)果一致。12日齡以后,各組均出現(xiàn)幼蟲(chóng)大量沉底現(xiàn)象,闕華勇等[13]雜交多倍體實(shí)驗(yàn)中也有類似現(xiàn)象出現(xiàn)。與對(duì)照組相比,雜交三倍體和誘導(dǎo)三倍體群體從浮游幼蟲(chóng)階段就表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),此結(jié)果與王昭萍等[16]結(jié)論一致。從三倍體率來(lái)看,雜交獲得100%的三倍體,較誘導(dǎo)群體組誘導(dǎo)率高且穩(wěn)定。

通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)三倍體群體和雜交三倍體的對(duì)比,從卵裂率、D幼率、存活率、生長(zhǎng)發(fā)育和倍性等方面均體現(xiàn)了雜交三倍體具有優(yōu)勢(shì)。在稚貝期將誘導(dǎo)三倍體群體中的三倍體與雜交三倍體進(jìn)行生長(zhǎng)比較,雜交三倍體稍大于前者,但是差異不顯著,這與王昭萍等[27]結(jié)果相吻合。分析本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體之間的生長(zhǎng)差異原因可能有2個(gè):一是在誘導(dǎo)三倍體群體中二倍體含量過(guò)高,降低了三倍體的實(shí)際生長(zhǎng)水平;二是雜交三倍體是中美牡蠣雜交,即為兩種不同地理群體雜交,表現(xiàn)出了雜種優(yōu)勢(shì)。而誘導(dǎo)群體中的二倍體則比二倍體對(duì)照組生長(zhǎng)快,可能是誘導(dǎo)群體中的二倍體經(jīng)過(guò)了藥物處理所致。

雜交獲得三倍體即為誘導(dǎo)多倍體方法中的生物方法,該方法簡(jiǎn)單易操作,三倍體率高達(dá)100%,避免了理化處理對(duì)胚胎發(fā)育和環(huán)境的影響。這同陶抵輝、于瑞海等[17]觀點(diǎn)一致。此結(jié)果同時(shí)也驗(yàn)證了雜交三倍體在生產(chǎn)應(yīng)用上的可行性,同先前的于瑞海等[18]研究結(jié)果一致。

雜交獲得三倍體的方法具有很多優(yōu)點(diǎn),但雜交方法中的四倍體親本的獲得是該方法的關(guān)鍵,也是瓶頸。雖有很多種養(yǎng)殖牡蠣[8,19-21]進(jìn)行四倍體誘導(dǎo),但目前只有太平洋牡蠣、美洲牡蠣和近江牡蠣建立了穩(wěn)定的四倍體群系[22-24]。故四倍體的研究仍是多倍體方面需要繼續(xù)探索的一個(gè)方向。

闕華勇等進(jìn)行了四倍體太平洋牡蠣(G)和二倍體近江牡蠣(A)的雜交試驗(yàn)[25]。種間雜交子代GGA組幼蟲(chóng)個(gè)體較GA組大,眼點(diǎn)幼蟲(chóng)形成也在GA組之前。同時(shí)證實(shí)了雜交三倍體兼具了兩親本的特性,如適鹽范圍變寬了。而本實(shí)驗(yàn)兩親本太平洋牡蠣分別來(lái)自于中國(guó)威海和美國(guó)華盛頓,為種內(nèi)雜交三倍體子代。種內(nèi)雜交,是目前雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑[26]。本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)子代的生理等進(jìn)行試驗(yàn),不能確定是否兼具不同地理群體兩親本的優(yōu)勢(shì),是本實(shí)驗(yàn)需要繼續(xù)研究的一個(gè)方向。

牡蠣作為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類之一,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)雜交三倍體和誘導(dǎo)三倍體群體的生長(zhǎng)狀況具體比較,驗(yàn)證雜交的方法獲得的全三倍體,提高了牡蠣生產(chǎn)的產(chǎn)量,存活率也很高,適合在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用,是加速貝類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展的一個(gè)可行的重要方向。

致謝:感謝青島亞特蘭生物科技有限公司提供四倍體牡蠣親貝;青島嶗東海珍品良種培育有限公司郭希瑞、馬強(qiáng)、孫軍委等對(duì)本試驗(yàn)的幫助。

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