徐后國,艾慶輝,麥康森,徐 瑋,劉付志國

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用的益生菌,具有菌種單一、不產(chǎn)生耐藥性、無毒性等特點,作為益生菌亦具有耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓等特性,適合在飼料中添加使用。枯草芽胞桿菌在動物腸道內(nèi)代謝、增殖,可以調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體消化能力、增強(qiáng)免疫力和抗病力[1-5]。甲殼素是廣泛分布于節(jié)肢動物外殼、菌類及藻類細(xì)胞中的1種類纖維素天然高分子物質(zhì)。殼聚糖為甲殼素脫乙?；幚砗蟮漠a(chǎn)物,是1種堿性多糖,生物兼容性好,且具有生物降解,無毒等特性。殼寡糖是殼聚糖降解以后聚合度為2～10的產(chǎn)物,其水溶性好,容易被吸收利用,且生物活性比殼聚糖更強(qiáng)。甲殼素或殼聚糖提高水產(chǎn)動物免疫力和抗病力的功能已得到廣泛的證實[6-12]。殼寡糖抗氧化[13-14]、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[15-18]、促進(jìn)腸道菌群增殖[19]等作用雖然已被大量研究證實,然而,其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究卻幾乎沒有。

大黃魚屬鱸形目,石首魚科,黃魚屬,是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類。隨著大黃魚高密度集約化養(yǎng)殖的逐漸展開,大黃魚的病害情況也日益嚴(yán)重,而鑒于傳統(tǒng)藥物對食品安全和環(huán)境的危害,開發(fā)高效安全的新型免疫增強(qiáng)劑成為當(dāng)務(wù)之急。本實驗的目的是通過生長實驗探求枯草芽胞桿菌和殼寡糖對大黃魚幼魚非特定性免疫力的影響,為大黃魚高效環(huán)保配合飼料的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料制作

以魚粉(粗蛋白,69.7%;粗脂肪,7.1%)、豆粕(粗蛋白,53.3%;粗脂肪,1.9%)為蛋白源,魚油、大豆油和卵磷脂為脂肪源,小麥粉為糖源,并添加維生素混合物(mg or g/kg diet:維生素B1,25 mg;核黃素,45 mg;維生素B6,20 mg;維生素B12,0.1 mg;維生素K3,10 mg;肌醇,800 mg;維生素B3,60 mg;煙酸,200 mg;葉酸,20 mg;生物素1.20 mg;維生素A,32 mg;維生素D3,5 mg;維生素E,120 mg;維生素C,2 000 mg;氯化膽堿,2 500 mg;乙氧基喹啉,150 mg;小麥粉,18.52 g)、無機(jī)鹽混合物(mg or g/kg diet:氟化鈉,2 mg;碘化鉀,0.8 mg;1%氯化鈷,50 mg;硫酸銅,10 mg;硫酸鐵,80 mg;硫酸鋅,50 mg;硫酸錳,60 mg;硫酸鎂,1 200 m g;磷酸二氫鈣,3 000 mg;氯化鈉,100 mg;沸石粉,15.45 g)、誘食劑(甘氨酸+甜菜堿)、防霉劑(50%丙酸鈣+50%富馬酸)配制成基礎(chǔ)飼料(見表1)。

采用2×3雙因素設(shè)計,分別在基礎(chǔ)飼料中添加0(B0)(對照)、0.1%(B1)和0.2%(B2)的芽孢桿菌制劑(主要成分枯草芽孢桿菌1×1010cfu/g,青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司),每個芽孢桿菌水平添加0.0%(C0)(對照)、0.3%(C1)和0.6%(C2)的殼寡糖(脫乙酰度95%,分子量2000,純度95.48%,中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院),配制出9種等氮等能的實驗飼料:C0B0,C0B1,C0B2,C1B0,C1B1,C1B2,C2B0,C2B1和C2B2。在飼料制作過程中,所有原料粉碎后過320μm篩網(wǎng),各原料按配比定量后混合均勻,然后加入適量的水揉勻,經(jīng)F(Ⅱ)-26型雙螺桿擠條機(jī)(華南理工大學(xué),廣州)加工制成硬顆粒飼料(1.5 mm×2.0 mm,2.5 mm×3.0 mm),55℃烘干至飼料水分含量為10%左右,用塑料袋包裝,保存于-15℃冰柜中備用。經(jīng)測定枯草芽孢桿菌制粒損失率為2/3,則最終枯草芽孢桿菌的添加梯度為:0.0、0.5×107和1.0×107cfu/g。

表1 實驗飼料配方及營養(yǎng)成分組成Table 1 Formulation and p roximate composition of the experimental diets(%dry matter)

1.2 實驗魚的來源、馴化與養(yǎng)殖管理

實驗在浙江省寧波市象山縣西滬港進(jìn)行。大黃魚選用象山海灣育苗場當(dāng)年繁育的同一批魚苗。在開始正式實驗前,幼魚放于海水大網(wǎng)箱(3.0 m×3.0 m×3.0 m)中暫養(yǎng)2周,并以實驗基礎(chǔ)飼料(Diet 1)飽食投喂,使之逐漸適應(yīng)實驗飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。

實驗開始時,實驗魚饑餓24 h,然后稱質(zhì)量,并挑選出規(guī)格一致(平均初始體質(zhì)量為(7.82±0.68)g)的大黃魚進(jìn)行分組實驗。實驗在27個浮式海水網(wǎng)箱(1.0 m×1.0 m×1.5 m)中進(jìn)行,放養(yǎng)密度為60尾/箱。每一網(wǎng)箱為一組,每種飼料隨機(jī)投喂3組實驗魚。每天飽食投喂2次(05··00和17··00)。養(yǎng)殖周期70 d。每天記錄投飼量,如有死魚記錄數(shù)量并稱質(zhì)量。實驗期間海水水溫為22.5～31.5℃,鹽度為28～33,溶解氧含量在6 mg·L-1左右。

1.3 樣品收集

70 d生長實驗結(jié)束后,對實驗魚饑餓24 h,分別從每網(wǎng)箱抽取5尾魚,以無菌注射器自尾靜脈取血,室溫沉降2 h,然后4℃沉降4～6 h,分離血清并保存于-70℃冰箱。

1.4 免疫學(xué)指標(biāo)的測定

1.4.1 血清溶菌酶活力 血清中溶菌酶活力通過濁度比色法測定[20]。反應(yīng)底物為用磷酸緩沖溶液(0.05 mol·L-1、p H=6.1)配制的0.2 m g·m L-1微壁溶球菌(Sigma)懸液。100μL血清與1 900μL菌懸液混合,在530 nm波長下,分別在0.5和4.5 min測定吸光值(OD)?；盍挝欢x為每分鐘吸光值減少0.001所需的血清量。

1.4.2 血清替代途徑補體活力 血清中替代途徑補體活力參考Yano[21]的方法測定。將100μL兔血紅細(xì)胞(RaRBc)懸液(每毫升緩沖溶液含有2×108個細(xì)胞)加到250μL用緩沖溶液系列稀釋的魚血清中。不斷搖動,26℃反應(yīng)90 min。反應(yīng)結(jié)束時加入3.15mL冷的生理鹽水,然后離心5 min(3 000 r/min)。血清的溶血程度通過用分光光度計在414 nm測定上清液的吸光值?；盍挝欢x為使RaRBC發(fā)生50%溶解的血清量。

1.4.3 血清SOD活力 血清SOD活性使用南京建成試劑盒測定?；驹硎?通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O-2),O-2氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色,用可見光分光光度計測其吸光值。當(dāng)被測樣品中含SOD時,則對超氧陰離子有專一性的抑制作用,使形成的亞硝酸鹽減少,比色時測定管的吸光值低于對照管的吸光值,通過測定O-2被抑制的多少來確定SOD值的大小。血清中SOD酶活力單位定義為:每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD酶活單位(U)。

1.4.4 血清CA T活力 血清CA T活性使用南京建成試劑盒測定。基本原理是:過氧化氫酶分解H2O2的反應(yīng)可以通過加入鉬酸銨而迅速中止,剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生1種淡黃色的絡(luò)合物,在405 nm處測定其生成量,可計算出CA T的活力。每毫升血清每秒鐘分解1μmol H2O2的量為1個活力單位(U)。

1.5 計算及統(tǒng)計方法

采用SPSS 11.5 for Window s對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,若差異達(dá)到顯著,則進(jìn)行Tukey多重比較,顯著性水平為P<0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對血清溶菌酶活力的影響(見表2)

在每1個枯草芽孢桿菌添加水平,飼料中添加殼寡糖顯著提高了大黃魚幼魚的血清溶菌酶活力(P<0.05),而血清溶菌酶活力在添加殼寡糖的兩處理間沒有顯著性差異(P>0.05)。在每個殼寡糖水平,飼料中枯草芽孢桿菌的添加提高了大黃魚血清溶菌酶活力,但是血清溶菌酶活力在各枯草芽孢桿菌的添加水平差異不顯著(P>0.05)。血清溶菌酶活力在添加0.6%殼寡糖+0.5×107cfu/g枯草芽孢桿菌的處理組達(dá)到最大值。枯草芽孢桿菌和殼寡糖對溶菌酶活力的影響沒有顯著的交互作用(P>0.05)。

表2 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對大黃魚幼魚血清免疫指標(biāo)的影響Table 2 Effects of dietary supplementation with Bacillus subtilis and chito-oligosaccharide on serum immunological parameters of juvenile large yellow croaker(Pseudosciaena crocea)fed experimental diets for 70days(Means±S.E.M.)/m l-1

2.2 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對血清替代途徑補體活力的影響(見表2)

大黃魚幼魚的血清替代途徑補體活力在各處理組間均沒有顯著性差異(P>0.05)。殼寡糖和枯草芽孢桿菌對血清替代途徑補體活力的影響也沒有顯著的交互作用(P>0.05)。

2.3 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對血清超氧化物歧化酶(SOD)的影響(見表2)

在每個枯草芽孢桿菌水平,飼料中添加殼寡糖提高了大黃魚血清SOD活力,但是SOD活力在添加殼寡糖的處理組和未添加殼寡糖的處理組間沒有顯著性差異(P>0.05)。在每個殼寡糖水平,飼料中枯草芽孢桿菌的添加水平?jīng)]有對大黃魚血清SOD活力造成顯著性影響。大黃魚血清SOD值在添加0.3%殼寡糖+0枯草芽孢桿菌的處理組達(dá)到最大值。殼寡糖和枯草芽孢桿菌對血清SOD活力的影響沒有顯著的交互作用(P>0.05)。

2.4 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對血清過氧化氫酶(CA T)的影響(見表2)

大黃魚幼魚的CA T活力在各處理組間均沒有顯著性差異(P>0.05)。殼寡糖和枯草芽孢桿菌對血清CA T活力的影響也沒有顯著的交互作用(P>0.05)。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌的益生作用

枯草芽抱桿菌在動物腸道內(nèi)能大量消耗氧氣,形成腸道厭氧環(huán)境,扶持和促進(jìn)雙岐桿菌、乳酸菌等有益菌的增殖,同時,枯草芽孢桿菌還具有刺激動物免疫系統(tǒng)提高免疫力等作用?？莶菅挎邨U菌提高動物免疫機(jī)能的功能已經(jīng)在金頭鯛[22]、鯉[3,5]、羅非魚[4]及甲殼動物[23-24]上進(jìn)行的大量研究中得到證實。Kumar等[5]研究表明,飼料中添加1.5×107/g枯草芽孢桿菌能顯著提高鯉的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)能力,促進(jìn)非特異性免疫力的提高。A ly等[4]在羅非魚的研究中也證實飼料中添加107/g枯草芽孢桿菌顯著提高了羅非魚血液嗜中性粒細(xì)胞黏附力及血漿溶菌酶活力。

然而,本實驗結(jié)果卻表明,飼料中添加枯草芽孢桿菌并未對大黃魚幼魚血清免疫指標(biāo)產(chǎn)生顯著性影響。分析其原因,枯草芽孢桿菌沒有對大黃魚免疫反應(yīng)產(chǎn)生顯著性影響可能是因為殼寡糖的添加不但沒有對枯草芽孢桿菌的益生作用產(chǎn)生促進(jìn),反而對枯草芽孢桿菌發(fā)揮益生作用產(chǎn)生了抑制。因為殼寡(聚)糖具有廣譜的抗菌活性,其分子中帶有的游離氨基容極易結(jié)合氫離子而使殼寡(聚)糖分子帶正電荷,它可以吸附在菌體表面形成1層高分子膜阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的運輸[25],或者吸附細(xì)菌表面帶陰離子的物質(zhì)或鞭毛莢膜等結(jié)構(gòu)物質(zhì)而干擾細(xì)菌的正常代謝,小分子量的殼寡糖分子甚至可以滲透進(jìn)入到細(xì)菌體內(nèi)吸附陰離子物質(zhì),干擾細(xì)胞代謝。

3.2 殼寡糖的益生作用

本實驗中,飼料中殼寡糖的添加顯著提高了大黃魚血清溶菌酶水平,表明殼寡糖對海水魚的非特異性免疫力具有一定的提高作用。目前,關(guān)于甲殼素或殼聚糖對水產(chǎn)動物免疫力的影響已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究[7-12,26],證明甲殼素或殼聚糖能提高水產(chǎn)動物的呼吸爆發(fā)活性和溶菌酶活性,提高機(jī)體免疫力。Han等[16]也發(fā)現(xiàn)飼料中添加0.1%～0.3%的殼寡糖能促進(jìn)豬淋巴細(xì)胞的增殖及抗體生成。同時,一些體外實驗及浸泡實驗同樣證明了殼寡(聚)糖的免疫促進(jìn)功能[6,8,15,27]。

本實驗中,飼料中殼寡糖的添加未對大黃魚血清的血清替代途徑補體活力、超氧化物歧化酶活力及過氧化氫酶活力產(chǎn)生顯著性影響,這可能是由于不同的免疫指標(biāo)對同一種免疫刺激物質(zhì)會產(chǎn)生不同的反應(yīng)或產(chǎn)生反應(yīng)的時間不同,也可能與實驗用殼寡糖的聚合度、脫乙酰度、添加量及試驗魚的種類有關(guān)。

3.3 枯草芽孢桿菌與殼寡糖的交互作用

殼寡糖的益生元作用已經(jīng)得到證明,Lee等[19]的實驗證明,聚合度在2～8的殼寡糖可以有效促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌的增殖。同時添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖用于動物飼料的實驗還未有過報道。華雪銘等[28]研究發(fā)現(xiàn)同時在飼料中添加殼聚糖和益生菌對暗紋東方魨的生長無顯著影響。本實驗中,也并未觀察到枯草芽孢桿菌與殼寡糖的交互作用,其原因可能如上所述,殼寡糖具有抗菌活性,由于殼寡(聚)糖分子帶正電荷,分子中帶有的游離氨基可以與細(xì)胞表面帶陰離子的物質(zhì)或鞭毛莢膜等結(jié)構(gòu)物質(zhì)發(fā)生吸附,阻礙細(xì)菌正常代謝,或者結(jié)合氫離子在細(xì)菌表面形成1層高分子膜,阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的運輸,小分子的殼寡糖還可以通過滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞內(nèi)部帶陰離子的物質(zhì)發(fā)生吸附,干擾細(xì)菌細(xì)胞的正常代謝。所以,本實驗飼料中殼寡糖的添加可能會極大地抑制枯草芽孢桿菌作用的發(fā)揮。No等[29]在研究不同分子量殼寡(聚)糖對豆腐產(chǎn)品中腐生細(xì)菌的抑制作用時也發(fā)現(xiàn)不同分子量的殼寡(聚)糖對豆腐產(chǎn)品腐生細(xì)菌中的一些芽孢桿菌產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。而本實驗中,飼料中添加的殼寡糖對枯草芽孢桿菌的抑制作用可能過于嚴(yán)重,以致毀滅性地大黃魚幼魚血清免疫指標(biāo)的影響大黃魚幼魚血清免疫指標(biāo)的影響。

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