崔麗卿,徐 瑋,汪東風(fēng)

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島266003)

大菱鲆(Scophthalm usm axim us)為原產(chǎn)于歐洲沿海的冷水性鲆科魚(yú)類(lèi),該魚(yú)性格溫順、生長(zhǎng)迅速、肉質(zhì)鮮嫩,自1992年引入我國(guó),大菱鲆養(yǎng)殖已覆蓋山東、江蘇、浙江和福建等省份,成為我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[1]。然而隨著養(yǎng)殖密度的增加,水體環(huán)境的惡化,各種細(xì)菌性疾病、病毒性疾病、寄生蟲(chóng)疾病時(shí)有發(fā)生[2]?？股剡@類(lèi)藥物經(jīng)常用于病害的診治,但卻直接導(dǎo)致了耐藥菌株增加、藥物殘留等問(wèn)題。而在飼料中添加免疫刺激劑[3],通過(guò)增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物自身免疫力來(lái)預(yù)防疾病,例如β-葡聚糖、甘露聚糖等,已被證明是1種低成本、高效、環(huán)保的預(yù)防疾病的方式。

根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)對(duì)稀土元素的定義,稀土元素是指元素周期表第三副族中原子序數(shù)從57(La)至71(Lu)的15個(gè)元素(稱(chēng)為鑭系元素),再加上與其電子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似的鈧(Sc)和釔(Y)。我國(guó)有豐富的稀土資源[4],由于稀土具有促生長(zhǎng)的作用,已廣泛用于農(nóng)作物、畜禽和漁業(yè)養(yǎng)殖[5-7]中。朱伯清等[8]通過(guò)在中國(guó)對(duì)蝦的飼料中添加氯化稀土,其產(chǎn)量增加31%,但目前為止稀土作為免疫刺激劑用于大菱鲆養(yǎng)殖中還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以大菱鲆為研究對(duì)象,通過(guò)在飼料中添加稀土,考察其對(duì)魚(yú)體生長(zhǎng)指標(biāo)、非特異免疫力和抗病力的影響,以期為大菱鲆免疫刺激劑的開(kāi)發(fā)和合理應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

實(shí)驗(yàn)以魚(yú)粉(購(gòu)自青島七好有限公司)為主要蛋白源,魚(yú)油和大豆卵磷脂為主要脂肪源,小麥粉為糖源,配制粗蛋白含量為53.01%,粗脂肪含量為12.57%,灰分含量為9.50%的基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、240 mg/kg的硝酸稀土,經(jīng)制粒機(jī)加工成3.0 mm顆粒狀飼料,在50℃恒溫下干燥12 h,密封保存。硝酸稀土購(gòu)自河南商丘稀土微肥有限公司,經(jīng)ICP-OES(V ISTA-M PX,VARIAN)所測(cè)得到硝酸稀土中含鑭9.53%,鋱5.38%,鏑2.47%,銩1.72%,鈥1.51%,镥0.18%,即硝酸稀土中所含稀土總量為20.79%。

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)及樣品采集

實(shí)驗(yàn)用大菱鲆幼魚(yú)為當(dāng)年人工培育的同一批苗種。實(shí)驗(yàn)在青島國(guó)家海洋科學(xué)研究中心中國(guó)海洋大學(xué)科研基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前,大菱鲆于300 L玻璃鋼中暫養(yǎng),使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。實(shí)驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每桶放養(yǎng)40尾大菱鲆,每天投喂2次(7··00,18··00),采取飽食投喂。實(shí)驗(yàn)周期為8周,期間24 h連續(xù)充氧。

8周生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)大菱鲆饑餓24 h,然后計(jì)數(shù),稱(chēng)重。分別從每桶隨機(jī)取5尾魚(yú),用1 m L無(wú)菌注射器自尾靜脈取血,每組實(shí)驗(yàn)魚(yú)所得血液均分成2份:1份加肝素鈉抗凝后用于吞噬指數(shù)的測(cè)定;1份不加抗凝劑,于4℃冰箱中靜置過(guò)夜,吸取上層血清于1.5 m L離心管中,放于-70℃冰箱中用于酶活性測(cè)定。

1.3 樣品分析測(cè)定方法

1.3.1 吞噬指數(shù)(Phagocytic index,PI)測(cè)定 將金黃色葡萄球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中,放37℃搖床中培養(yǎng)12 h左右,4 000 r·min-1離心10 min,取沉淀,用無(wú)菌生理鹽水稀釋成1.7×109cfu/m L備用。

大菱鲆自尾靜脈取血后,每毫升血液中立即添加0.2 m L肝素鈉(濃度為1 500 U/m L),輕輕搖動(dòng)混勻。取100μL抗凝血,放入96孔培養(yǎng)板中,再加上述葡萄球菌菌液100μL充分混勻,37℃水浴30 min,其間每隔10 min搖勻1次。

作用完畢,取1小滴混合液置于潔凈無(wú)油污的載玻片一端,推成薄片。待干后,用Giemsa染液染色2～3 min,水洗,脫色,置油鏡下觀察。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)參與吞噬的中性粒細(xì)胞,同時(shí)記錄所吞噬的細(xì)菌數(shù)并計(jì)算吞噬指數(shù)。

吞噬指數(shù)=Po/100

式中,Po為參與吞噬的中性粒細(xì)胞所吞噬的細(xì)菌數(shù),100為參與吞噬的中性粒細(xì)胞數(shù)目。

1.3.2 超氧化岐化酶(Super oxide dismutase,SOD)活力測(cè)定 SOD活力測(cè)定,采用從南京建成生物工程研究所購(gòu)買(mǎi)的檢測(cè)試劑盒,相應(yīng)操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其中,SOD活力按黃嘌呤氧化酶法,活力單位定義為:每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U/m L)。

1.4 攻毒試驗(yàn)

生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,分別從每桶隨機(jī)選10尾魚(yú)進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。用一次性注射器通過(guò)腹腔注射遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)菌液0.2 m L/尾(菌液濃度為105cfu/mL),攻毒所用菌種由中國(guó)海洋大學(xué)生命學(xué)院提供,為大菱鲆腹水病病原菌。飼喂及飼養(yǎng)管理與飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間相同,同時(shí)記錄攻毒7 d后魚(yú)的死亡率。

1.5 計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析

(1)成活率(%)=(No-Nt)/No×100%

(2)增重率(%)=(Wt-Wo)/Wo×100%

(3)飼料系數(shù)=F/W

(4)特定生長(zhǎng)率(%/d)=(Ln Wt-Ln Wo)×100/t

(5)肝臟指數(shù)(%)=m1/Wt×100

(6)腎臟指數(shù)(%)=m2/Wt×100

式中,No和Nt分別為每桶初始和死亡的大菱鲆尾數(shù),Wo和Wt分別為大菱鲆的初始體重和終末體重(g),t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d),F為重復(fù)組飼料總攝入量,W為重復(fù)組總魚(yú)體增重,m1為每尾魚(yú)的肝臟質(zhì)量(g),m2為每尾魚(yú)的腎臟質(zhì)量(g)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行配對(duì)樣本T檢驗(yàn),均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(M ean±S.E.M),以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 稀土對(duì)大菱鲆增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)以及成活率的影響

稀土對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)8周飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后,飼料中添加稀土的大菱鲆成活率為93.7%,高于對(duì)照組(86.0%)。實(shí)驗(yàn)中大菱鲆的特定生長(zhǎng)率、增重率與成活率有相似的規(guī)律,即與對(duì)照組相比,稀土組大菱鲆特定生長(zhǎng)率提高了15.79%,增重率提高了26.88%,而稀土組的飼料系數(shù)為0.9,顯著低于對(duì)照組(1.6)(P<0.05)。

表1 稀土對(duì)大菱鲆增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)以及成活率的影響Table 1 Effects of rare earth elements on weight gain rate,specific grow th rate,feed coefficient and survival of Scophthalm usm ax im us

2.2 稀土對(duì)大菱鲆吞噬指數(shù)、肝臟指數(shù)以及腎臟指數(shù)的影響

稀土對(duì)大菱鲆吞噬指數(shù)、肝臟指數(shù)以及腎臟指數(shù)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。飼料中添加稀土的大菱鲆吞噬指數(shù)為117.2,高于對(duì)照組(114.0)。與對(duì)照組相比,稀土組大菱鲆肝臟指數(shù)提高了24.70%,腎臟指數(shù)提高了9.52%。

表2 稀土對(duì)大菱鲆吞噬指數(shù)、肝臟指數(shù)以及腎臟指數(shù)的影響Table 2 Effects of rare earth elements on phagocytic index,liver index and renal index of Scophthalmusmaxim us

2.3 稀土對(duì)大菱鲆超氧化歧化酶的影響

稀土對(duì)大菱鲆超氧化歧化酶的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。飼料中添加稀土的大菱鲆SOD酶活為58.3,高于對(duì)照組(53.6)。

圖1 稀土對(duì)大菱鲆超氧化歧化酶的影響Fig.1 Effects of rare earth elements on super oxide dismutase of Scophthalmusmaximus

2.4 稀土對(duì)由遲緩愛(ài)德華氏菌所感染的大菱鲆死亡率的影響

稀土對(duì)由遲緩愛(ài)德華氏菌所感染的大菱鲆死亡率影響的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。經(jīng)過(guò)7d的攻毒實(shí)驗(yàn),稀土組的死亡率低于正常組,飼料中添加稀土可以提高大菱鲆抵抗腹水病的能力。

圖2 稀土對(duì)由遲緩愛(ài)德華氏菌所感染的大菱鲆死亡率的影響Fig.2 Effects of rare earth elements on mo rtality of Scophthalm usm axim us,challenged with Echw ardsiella tarda

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中硝酸稀土的添加劑量為240 mg/kg,而硝酸稀土中所含稀土為20.79%,即飼料中稀土的有效含量為49.90 m g/kg,而中國(guó)稀土農(nóng)用網(wǎng)[9]發(fā)布的:魚(yú)類(lèi)飼料中的稀土以50 mg/kg為宜,兩者數(shù)據(jù)相近。經(jīng)過(guò)8周的飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn),飼料中添加稀土后,大菱鲆的成活率提高了8.95%,而且特定生長(zhǎng)率提高了15.79%,增重率提高了26.88%。而飼料系數(shù)降低了43.75%,這與以前的研究結(jié)果相類(lèi)似。江振瑩[10]用700 g/m3稀土溶液浸泡魚(yú)體,結(jié)果鯉魚(yú)體增重16.1%,同時(shí)鯉魚(yú)的成活率也提高了。石文雷等[11]研究表明,飼料中添加Vc稀土(團(tuán)頭魴36.94～42.77 mg/kg,草魚(yú)54.56～58.87 mg/kg)可促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng),降低餌料系數(shù),并且提高成活率。

吞噬能力是魚(yú)類(lèi)的非特異性免疫功能的重要組成部分,當(dāng)細(xì)菌等異物侵入機(jī)體時(shí),血液中的白細(xì)胞會(huì)發(fā)揮趨化作用向其聚集,通過(guò)胞吞作用將異物吞噬。本實(shí)驗(yàn)飼料中添加稀土喂養(yǎng)的大菱鲆血液中性粒細(xì)胞的吞噬指數(shù)高于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,稀土有效地激活大菱鲆吞噬細(xì)胞的吞噬功能,從而使其非特異性免疫力得到改善與提高。申秀英等[12]證實(shí),中、低濃度的鈰顯著增加大鼠血液中性粒細(xì)胞的數(shù)量,并且低濃度的鈰使淋巴細(xì)胞所占白細(xì)胞的比例升高,提高了大鼠的免疫力。王宗惠等[13]研究發(fā)現(xiàn),在4～125μg/mL劑量范圍內(nèi),稀土能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞特異吞噬功能,并呈劑量反應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。馬文強(qiáng)等[14]表明,補(bǔ)充一定量的稀土元素,可改善機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。而有關(guān)稀土提高吞噬指數(shù)的機(jī)理,也有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)的研究。M izgerd等[15]的研究表明,稀土能夠被巨噬細(xì)胞所吞噬從而促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡。

SOD酶具有清除活性氧的功能,是生物體內(nèi)主要抗氧化酶類(lèi)之一,在防御機(jī)體衰老方面有極為重要的作用。本實(shí)驗(yàn)飼料中添加稀土喂養(yǎng)的大菱鲆SOD酶活性高于對(duì)照組。稀土離子半徑較小,表現(xiàn)為硬酸性,容易與作為硬堿的氧結(jié)合[16],可以通過(guò)此機(jī)制清除活性氧?；钚匝醯臄?shù)量與殺菌力存在相關(guān)關(guān)系,是反映非特異性免疫能力的一項(xiàng)指標(biāo)。汪承潤(rùn)等[17]研究發(fā)現(xiàn),低劑量硝酸鈥可增強(qiáng)機(jī)體SOD、CAT、POD 3種抗氧化酶活力。Y.Chen等[18]研究表明,金魚(yú)經(jīng)過(guò)18 d La3+、Gd3+、Y3+浸浴處理后,肝臟SOD酶活的增加率分別為15.58%、16.8%和24.8%;而經(jīng)過(guò)La-ED TA、Gd-ED TA、Y-ED TA處理后,肝臟SOD酶活的增加率分別為16.4%、22.6%和35.2%。邵紅星[19]等研究發(fā)現(xiàn),在飼料中添加500m g/kg的“常樂(lè)”稀土后,鯉魚(yú)肝胰臟CA T酶活達(dá)到最大值。

攻毒實(shí)驗(yàn)是免疫刺激劑效果最直觀的反映方式,遲緩愛(ài)德華氏菌[20]是大菱鲆腹水病的主要致病菌之一。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,攝食稀土后大菱鲆抵抗遲緩愛(ài)德華氏菌感染的能力增強(qiáng),這與吞噬指數(shù)、超氧化岐化酶所反映的非特異免疫力的指標(biāo)有著相似的規(guī)律。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究首次研究了稀土對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)以及非特異性免疫力的影響。結(jié)果表明,飼料中添加稀土能促進(jìn)大菱鲆生長(zhǎng),提高機(jī)體免疫力,增強(qiáng)抗病力,將其應(yīng)用為大菱鲆免疫刺激劑具有廣闊的前景。但稀土在海水養(yǎng)殖方面實(shí)際應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究,例如針對(duì)不同水產(chǎn)動(dòng)物在不同的生長(zhǎng)階段,施用的方式以及添加劑量的選擇也是不同的;稀土對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力影響的機(jī)理研究報(bào)道很少。

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