◎ 文/于涵 郭貴良 牛小天 鄭偉 王桂芹

水產(chǎn)動物三倍體育種技術(shù)能夠培育出高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)、抗病力強(qiáng)的苗種，是水產(chǎn)動物育種領(lǐng)域研究熱點之一。文章系統(tǒng)地梳理了國內(nèi)外研究者對水產(chǎn)動物三倍體育種技術(shù)的研究，在回顧相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對該技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程、研究品種、研究內(nèi)容等進(jìn)行了特征總結(jié)，以期為后續(xù)更深入的研究提供參考。

20世紀(jì)中期以來，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展為全人類食品供給作出了巨大貢獻(xiàn)。隨著全球經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的生活水平日益提升，對高品質(zhì)食物攝入的需求也在逐步提高，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)顯得尤為重要。在此背景下，培育高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)、抗病力強(qiáng)的水產(chǎn)動物品種乃大勢所趨。為培育出更能滿足人類需求的水產(chǎn)動物，近年來，國內(nèi)外相關(guān)專家致力于水產(chǎn)動物三倍體研究，已取得了豐碩的成果。

三倍體是指生物體細(xì)胞中含有三個染色體組的個體。水產(chǎn)動物三倍體育種技術(shù)是“染色體組工程”的一部分，是指通過一定的誘導(dǎo)方式增加水產(chǎn)動物的染色體組來改造水產(chǎn)動物的遺傳基礎(chǔ)，從而培育出性狀優(yōu)良的水產(chǎn)動物品種，以滿足人們的需求。通過三倍體育種技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的三倍體水產(chǎn)動物在理論上是不可育的。由于三倍體自身的不育性，所以沒有性成熟時用于性腺發(fā)育的能量消耗，同時也能夠避免水產(chǎn)動物因產(chǎn)卵而導(dǎo)致的生長停滯及身體損傷，因此大多數(shù)三倍體水產(chǎn)動物會比與其同種類同時期的二倍體有更快的生長速度、更好的品質(zhì)、更長的生命周期、更高的經(jīng)濟(jì)價值。

目前，水產(chǎn)動物三倍體育種方式概括起來可以分為物理、化學(xué)和生物三種。物理誘導(dǎo)方式主要有冷休克誘導(dǎo)、熱休克誘導(dǎo)、靜水壓休克誘導(dǎo)等方式；化學(xué)誘導(dǎo)方式主要有細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)、秋水仙素誘導(dǎo)、咖啡因誘導(dǎo)等方式；生物方式主要是遠(yuǎn)緣雜交、核移植和細(xì)胞融合等方式。在進(jìn)行水產(chǎn)動物三倍體誘導(dǎo)時可根據(jù)研究對象的不同特點來選擇合適的方式進(jìn)行誘導(dǎo)以達(dá)到最佳效果。

本文在回顧國內(nèi)外水產(chǎn)動物三倍體育種技術(shù)研究文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，總結(jié)了國內(nèi)外研究的各自特點，并提出了可以重點發(fā)展的方向，以期為后續(xù)水產(chǎn)動物三倍體育種技術(shù)的深入研究提供參考。

一、國外水產(chǎn)動物三倍體育種技術(shù)的研究進(jìn)展

關(guān)于水產(chǎn)動物三倍體誘導(dǎo)的報道，最早可追溯到20世紀(jì)40年代，Mrkino和Ojima以鯉魚為研究對象，將鯉魚受精卵進(jìn)行冷休克誘導(dǎo)處理（處理條件：受精后5min～10min，溫度0.5℃～3℃處理10min～30min），處理后經(jīng)細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，通過冷休克處理能有效地抑制卵子的第二次減數(shù)分裂，保留了原本將成為第二極體的單倍體染色體組，從而引起卵子的染色體組加倍，形成了二倍體卵核。與此同時，二人提出當(dāng)二倍體卵核與單倍體精核結(jié)合后，可能形成三倍體的合子進(jìn)而發(fā)育產(chǎn)生三倍體個體。雖然并沒有后續(xù)報道說明兩位研究者的實驗結(jié)果最后是否培育出了三倍體成魚，但這一實驗過程為后來進(jìn)行人工誘導(dǎo)水產(chǎn)動物三倍體的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

最早成功誘導(dǎo)出水產(chǎn)動物三倍體的研究者是Swarup，他采用冷休克方式成功地誘導(dǎo)出了三棘刺魚的三倍體（處理條件：受精后3min，溫度0℃處理1.5h～3h），并且經(jīng)過飼養(yǎng)實驗將三倍體三棘刺魚培育至性成熟。1972年，Purdom通過冷休克對海水經(jīng)濟(jì)魚類鰈和川鰈雜種進(jìn)行人工誘導(dǎo)三倍體獲得了成功（處理條件：受精后15min，溫度0℃處理3.5h），并養(yǎng)至成魚。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者開始嘗試通過化學(xué)方式進(jìn)行水產(chǎn)動物三倍體的誘導(dǎo)。1979年，Aellen等通過注射細(xì)胞松弛素B的方式對大西洋鮭進(jìn)行了三倍體的制備（處理條件：受精后32h，濃度10μg/mL處理12h），最終得到了嵌合體仔魚。

到20世紀(jì)80、90年代后，越來越多的研究者投入到了水產(chǎn)動物三倍體育種研究工作中，這一時期，水產(chǎn)動物三倍體育種研究工作不僅在研究品種上豐富起來，在研究結(jié)果上也較為成功，此時，通過實驗已經(jīng)可以獲得較高的三倍體誘導(dǎo)率。Colombo等采用冷休克方式對狼鱸進(jìn)行了三倍體的誘導(dǎo)（處理條件：受精后5min，溫度0℃～2℃處理20min），得到了90%左右的三倍體率；Gorshkov等通過熱休克方法對金鯛進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)（處理條件：受精后3min，溫度37℃處理5min），結(jié)果顯示三倍體誘導(dǎo)率100%；Holmefjord等采用熱休克方式對庸鰈進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)（處理條件：受精后15min，溫度24℃處理15min～30min），得到的三倍體誘導(dǎo)率為84%。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，對水產(chǎn)動物三倍體育種的研究進(jìn)入了快速發(fā)展階段，取得了一系列重大研究成果，這期間，除了研究品種的增多外，在研究內(nèi)容上也變得更加豐富，研究者在人工誘導(dǎo)三倍體的基礎(chǔ)上，開展了三倍體與普通二倍體的差異化分析研究工作。通過對比發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)水產(chǎn)動物三倍體與普通二倍體在生長發(fā)育過程中存在差異，且三倍體在性狀表現(xiàn)上普遍比二倍體更顯優(yōu)勢。Leal等通過對比實驗發(fā)現(xiàn)，三倍體高首鱘相比二倍體對環(huán)境脅迫有更高的敏感性；Matti等對二倍體和三倍體虹鱒進(jìn)行了生長比較，發(fā)現(xiàn)在生長期三倍體組的日生長系數(shù)均值和飼料轉(zhuǎn)化率均高于二倍體；挪威研究者通過將三倍體和二倍體大西洋鮭魚進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)三倍體具有比二倍體更好的淡水和早期海水生長性能。當(dāng)然也有一些研究表明在某些種類上，三倍體與二倍體差異不明顯或三倍體與二倍體相比處于劣勢。研究者在進(jìn)行細(xì)鱗大馬哈魚三倍體誘導(dǎo)后，通過對比實驗發(fā)現(xiàn)，細(xì)鱗大馬哈魚三倍體成魚的生長性能明顯比二倍體差；在對北極紅點鮭研究中，發(fā)現(xiàn)從幼魚到成魚的過程中，三倍體與二倍體在生長上沒有顯著差異。

目前為止，國外研究者已在近50余種水產(chǎn)動物中成功誘導(dǎo)出了三倍體，研究的對象包括虹鱒、美洲牡蠣、哲羅鮭、馬蘇大麻哈、大菱鲆等。所誘導(dǎo)種類中，虹鱒、大西洋鮭等三倍體育種體系最為成熟，并已開始在世界范圍內(nèi)廣泛地開展商業(yè)化養(yǎng)殖。

二、國內(nèi)水產(chǎn)動物三倍體育種技術(shù)的研究進(jìn)展

我國水產(chǎn)動物三倍體育種工作開始于20世紀(jì)70年代。1976年，我國研究人員通過溫度休克法對草魚進(jìn)行了三倍體誘導(dǎo)，通過實驗獲得了約57%的草魚三倍體，由此開啟了我國水產(chǎn)動物三倍體育種的研究工作。

20世紀(jì)80、90年代，我國水產(chǎn)動物三倍體育種研究工作開始快速發(fā)展，這一時期，在三倍體誘導(dǎo)方法上仍多采用物理方式，并且隨著配套技術(shù)的完善，更多使用一些專業(yè)儀器來進(jìn)行三倍體的制備。桂建芳等通過使用靜水壓力機(jī)對水晶彩鯽進(jìn)行靜水壓處理（處理條件：受精后4min～5min，壓力65MPa處理3min）成功獲得了三倍體成魚；尹洪濱等通過靜水壓方式對鯰魚進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)（處理條件：受精后4min～5min，壓力60MPa～64MPa處理3min）得到了鯰魚三倍體幼魚；付佩勝等對淡水鯧進(jìn)行了靜水壓處理（處理條件：受精后4min，壓力60MPa處理1.5min）獲得了三倍體胚胎。

21世紀(jì)以來，我國水產(chǎn)動物三倍體研究工作在研究內(nèi)容上也逐漸豐富起來，除了研究種類增多外，也開始更多地關(guān)注三倍體與二倍體的差異性研究以及對水產(chǎn)動物三倍體制備條件的探討。在差異性研究方面，魏凱等對二、三倍體細(xì)鱗鮭幼魚進(jìn)行了為期90d的飼養(yǎng)實驗，分別測定了實驗魚的體長、體重、肥滿度、存活率等生長指標(biāo)，綜合結(jié)果顯示，三倍體細(xì)鱗鮭幼魚的生長特性要明顯地優(yōu)于二倍體幼魚；李寶玉等同時對二、三倍體團(tuán)頭魴進(jìn)行生長對比實驗，對團(tuán)頭魴二、三倍體的生長性能進(jìn)行了評價，結(jié)果表明，在一齡之前，三倍體生長速度與二倍體相近，一齡后三倍體生長速度較二倍體快，生長優(yōu)勢表現(xiàn)明顯；江濤為了解二、三倍體黃顙魚的形態(tài)特征區(qū)別，選取了性成熟的黃顙魚二、三倍體雌雄個體，分別測量了全長、體長、體高等魚體各形態(tài)指標(biāo)，根據(jù)測量結(jié)果比較研究，得出結(jié)論：同時期的三倍體黃顙魚在體積上比二倍體黃顙魚大，并且頭部、腹鰭、背鰭和尾部等大部分結(jié)構(gòu)都比二倍體大。

在三倍體制備條件方面，付佩勝等對靜水壓休克法誘導(dǎo)淡水鯧魚三倍體的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了探究，結(jié)果表明，在精卵結(jié)合4min時，采用60MPa靜水壓處理1.5min，可獲得最高三倍體誘導(dǎo)率；尤穎哲在進(jìn)行雙斑東方鲀?nèi)扼w誘導(dǎo)條件研究時，通過對比實驗結(jié)果表明：在水溫18℃～20℃，受精后5min，采用10MPa～15MPa的靜水壓強(qiáng)，對雙斑東方鲀處理5min～7min誘導(dǎo)效果最好，可獲得96.67%以上的三倍體誘導(dǎo)率，并且孵化率能達(dá)到77%以上；張薇薇等在石斑魚受精6min后，采用溫度為4℃～6℃的冷休克對石斑魚誘導(dǎo)17.5min，獲得了最高三倍體率約80%左右。

從20世紀(jì)70年代中期開始，至今，我國水產(chǎn)動物三倍體育種工作已有近50年的歷程，收獲頗多。通過研究，目前已獲得草魚、鯉魚、鰱魚、鯽魚、虹鱒、大鱗副泥鰍、牙鲆、馬蘇大麻哈、半滑舌鰨、合浦珠母貝等多種水產(chǎn)動物的三倍體，其中三倍體的異育銀鯽、湘云鯽、湘云鯉已進(jìn)入到了實用化的生產(chǎn)階段。

三、小結(jié)與展望

三倍體育種技術(shù)在20世紀(jì)末非常盛行，研究的人也很多，但在當(dāng)時只是作為一種新的生物工程技術(shù)在研究，雖然當(dāng)時國內(nèi)外研究者已獲得了多種水產(chǎn)動物的三倍體，但在所研究的品種中，多數(shù)品種的三倍體育種研究仍處于實驗室階段，由于相關(guān)配套技術(shù)的制約無法廣泛運用到實際生產(chǎn)中，在生產(chǎn)上的針對性不強(qiáng)，因而沒能顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，所以自21世紀(jì)開始，研究此技術(shù)的人逐漸減少。近幾年，隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展和提高，以及水產(chǎn)育種技術(shù)的更加精細(xì)化，人們開始更有針對性地將三倍體技術(shù)應(yīng)用到水產(chǎn)育種當(dāng)中，使得三倍體育種技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展。例如陸封型馬蘇大馬哈魚品質(zhì)優(yōu)良，發(fā)展前景極為廣闊，但制約其進(jìn)一步發(fā)展的因素就是性成熟時個體很小，而且性成熟后便立即死亡，為能夠獲得較大個體的陸封型馬蘇大馬哈魚，人們開始期待并嘗試通過三倍體育種技術(shù)來制備三倍體苗種。再比如灘頭魚，是非常優(yōu)良的養(yǎng)殖品種，但生長速度較慢，所以或許人們也可以通過三倍體育種技術(shù)來解決灘頭魚生長較慢的問題。由于三倍體育種技術(shù)在使用上變得更具有針對性，再加上其技術(shù)更加成熟，因而使得三倍體育種技術(shù)迎來了新一輪的研究高峰。

雖然目前國內(nèi)外學(xué)者已在水產(chǎn)動物三倍體育種方面進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的成果，但從總體來看，仍存在值得進(jìn)一步研究和改進(jìn)之處。

在當(dāng)前的研究中，雖然可以通過對受精卵的處理得到較高的三倍體誘導(dǎo)率，但在后續(xù)的孵化過程中一些品種三倍體的成活率較低，這在很大程度上是由于處理過程中誘導(dǎo)方法不完善所導(dǎo)致的。在水產(chǎn)動物三倍體誘導(dǎo)的三種方式中，生物方式在誘導(dǎo)過程中操作較為復(fù)雜，并且易出現(xiàn)嵌合體，會改變優(yōu)勢性狀，所以應(yīng)用相對較少；化學(xué)方式雖可以成功誘導(dǎo)出三倍體，但其成本較高，部分化學(xué)誘導(dǎo)劑具有毒性，對養(yǎng)殖對象和養(yǎng)殖環(huán)境都有一定的影響，所以在使用上存在一定的限制性；應(yīng)用較為普遍的是物理方式，其中對溫度變化較為敏感的水產(chǎn)動物可以采用溫度休克法對其進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)，一般冷水性動物使用熱休克誘導(dǎo)，熱水性動物使用冷休克誘導(dǎo)；而對溫度敏感性較低的水產(chǎn)動物，如勃氏雅羅魚、水晶彩鯽等溫水性動物宜采用靜水壓休克法來進(jìn)行三倍體的誘導(dǎo)。

雖然物理方式不會影響環(huán)境，處理程序也相對標(biāo)準(zhǔn)化，但采用物理方法進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)時，誘導(dǎo)效果也會受到處理開始的時間、處理強(qiáng)度的大小以及處理的持續(xù)時間所限制。

比如處理開始的時間選擇，處理過早或過晚都會直接影響三倍體誘導(dǎo)率，只有準(zhǔn)確找出三倍體開始誘導(dǎo)的最佳時間，才能獲得更好的誘導(dǎo)效果。為此建議，可以通過采取對受精卵進(jìn)行切片觀察的方式來開展受精細(xì)胞學(xué)研究，充分了解受精卵發(fā)育的具體過程，從而準(zhǔn)確找出進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)的最佳開始時間，以優(yōu)化三倍體誘導(dǎo)方法，最終提高三倍體誘導(dǎo)率及成活率。

再比如處理強(qiáng)度和處理持續(xù)時間的問題，對受精卵來說處理強(qiáng)度過大或處理時間過長都會影響受精卵的成活率；而處理強(qiáng)度過小或處理時間過短又達(dá)不到誘導(dǎo)的效果；而且在進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)時不同種類的水產(chǎn)動物所需的處理強(qiáng)度和處理持續(xù)時間也不同。所以在使用物理方法誘導(dǎo)三倍體生產(chǎn)時，在找準(zhǔn)處理開始時間的基礎(chǔ)上，可以通過進(jìn)行對比試驗的方式來確定處理強(qiáng)度的大小和處理持續(xù)時間的長短，從而得出最佳的三倍體誘導(dǎo)條件。

水產(chǎn)動物三倍體具有生長速度快，品質(zhì)高，生命周期長等養(yǎng)殖優(yōu)勢。若將三倍體育種技術(shù)廣泛應(yīng)用于名特優(yōu)水產(chǎn)動物育種研究中，可大幅度提升養(yǎng)殖動物品質(zhì)、提高養(yǎng)殖動物生長速度、增加養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)效益，從而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。