溫海深,王宇龍,姜 龍,李吉方,何 峰,劉 淼

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

細(xì)胞色素P450芳香化酶(P450arom)作為P450細(xì)胞色素酶超家族中的一員,是類固醇生成途徑中的末端酶,它是雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵限速酶[1]。它能夠催化某些雄激素(如睪酮和雄烯二酮)轉(zhuǎn)化為雌激素,對(duì)調(diào)節(jié)整個(gè)性類固醇激素的平衡有重要意義[2]。在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中,P450arom由CYP19單基因編碼,但在魚類中存在2種P450芳香化酶,分別為性腺型芳香化化酶(P450arom A)和腦型芳香化酶(P450aromB),它們由不同的基因(CYP19A和CYP19B)編碼,具有獨(dú)特的功能[3]。至今,已經(jīng)在10余種魚類中克隆了CYP19基因,并對(duì)功能進(jìn)行了初步研究[4]。

由于環(huán)境條件改變、個(gè)體差異及食物分布不均等原因,魚類經(jīng)常遭受饑餓脅迫。近年來,饑餓脅迫對(duì)魚類生理機(jī)能變化研究成為魚類營養(yǎng)與環(huán)境生理學(xué)交叉學(xué)科的熱點(diǎn)問題之一,特別是饑餓后的消化生理機(jī)能研究報(bào)道較多,例如補(bǔ)償生長(zhǎng)現(xiàn)象。魚類補(bǔ)償生長(zhǎng)現(xiàn)象是魚類遇到饑餓脅迫,恢復(fù)攝食后生長(zhǎng)率高于正常攝食狀態(tài),體重增加最終達(dá)到或超過正常投喂魚的現(xiàn)象。魚類補(bǔ)償生長(zhǎng)的研究可用來指導(dǎo)制訂科學(xué)的投食制度而獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益,迄今為止,國內(nèi)外先后研究了鮭科魚類、鯉科魚類、鱈科魚類、鰈科魚類等近30余種魚類的補(bǔ)償生長(zhǎng)。在我國1990年代以后開始研究,涉及魚類如南方鲇(Silurusmerid ionalis)[5]、鯉魚(Cyprinus carpio)[6]、美國紅魚(Sciaenops ocellatus)[7]、異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[8]、錦鯉(Cyprinus carpio,variation)[9]。真鯛(Pagrus major)[10]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[11]。但是,關(guān)于魚類補(bǔ)償生長(zhǎng)過程中繁殖生理機(jī)能變化研究未見報(bào)道。本文以繁殖生理研究的模式動(dòng)物金魚(Carassius auratus,variation)為對(duì)象,側(cè)重研究性激素合成關(guān)鍵酶基因(CYP19A和CYP19B)表達(dá)對(duì)饑餓的響應(yīng)機(jī)制,通過這些研究,在理論上豐富魚類繁殖生理學(xué)內(nèi)容,在實(shí)踐上為制定科學(xué)合理的親魚投喂計(jì)劃提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的金魚于2009年11月5日購于青島市某金魚養(yǎng)殖場(chǎng),為同一批親魚孵化。選用同一規(guī)格的健康活潑的雌性個(gè)體84尾,在4個(gè)規(guī)格為30 cm×60 cm×30 cm的玻璃水族箱內(nèi)暫養(yǎng)(每箱21尾)10 d,每日投喂同種配合飼料2次至飽食。暫養(yǎng)后金魚體長(zhǎng)為(6.6±0.8)cm,體質(zhì)量為(38.8±10.1)g,卵巢發(fā)育為III期。暫養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣,日換水量2/3,日光照時(shí)間12 h。暫養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)用水為提前經(jīng)過2 d曝氣并調(diào)好水溫的自來水,水溫(18.1±0.8)℃,p H值為7.84～8.12,硬度為4.46 mmol/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及取樣

設(shè)1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)饑餓處理組,分別為A組(對(duì)照組,持續(xù)投喂15d,放魚48尾)、B組(饑餓5 d,放魚12尾)、C組(饑餓10 d,放魚12尾)和D組(饑餓15 d,放魚12尾)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為15 d。取樣時(shí)間:第0天,取A組;第5天,取B組;第10天,取C組;第15天,取D組。每次取樣每組取3尾,每尾采集的組織為心、肝、脾、腎臟、卵巢、鰓、腦、頭腎、腸和肌肉,采集時(shí)放入液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑來源

本實(shí)驗(yàn)所用18S和PCR特異性引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。Taq酶、DNase(RNasefree)、RNasin、RNA提取試劑Trizol Reagent、M-MLV購自TaKaRa公司,普通瓊脂糖凝膠、Marker、購自北京天根生化科技有限公司,其余為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 基因表達(dá)

1.4.1 組織總RNA的提取及RNA中DNA去除取-80℃保存的腸、鰓、心、脾、腎、頭腎、精巢、肝、肌肉、腦組織各100 m g,用RNAiso Reagent抽提總RNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。以DNase I酶去除基因組DNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。

1.4.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 根據(jù)TaKaRa公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄體系(RNA 1μg,Oligo-d T18 1μL,補(bǔ)充RNase-free水至6μL)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。70℃加熱10 min,后迅速在冰上冷卻。繼續(xù)加入MMLV Buffer 2μL,M-MLV 1μL,Rnase inhibito r 0.25 μL,dN TPs 0.5μL。經(jīng)過42℃60 min,70℃15 min,95℃加熱5 m in,反應(yīng)結(jié)束。合成的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 CYP19基因的組織表達(dá) 將cDNA稀釋10倍后取1μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)PCR特異性引物CYP19A F、CYP19AR、CYP19B F和CYP19BR(見表1和2),特異性片段長(zhǎng)162 bp。PCR反應(yīng)條件為94℃5 min,94℃30 s、61.2℃(A)&60.9℃(B)30 s、72℃30 s共45個(gè)循環(huán),72℃10 min。18S rRNA作為反應(yīng)的內(nèi)參照物。取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。對(duì)電泳結(jié)果采用Tanon GIS凝膠圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4.4 饑餓對(duì)CYP19基因在腦和卵巢中表達(dá)的影響

隨機(jī)選饑餓0(對(duì)照組)、5、10和15 d的金魚各3條,取每條魚的腦和性腺2個(gè)組織提取RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,并稀釋后進(jìn)行不同饑餓時(shí)間的CYP19A和CYP19B基因表達(dá)分析,反應(yīng)條件同上。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示,不同處理組數(shù)據(jù)采用ANOVA單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS l2.0軟件。某組織的CYP19基因相對(duì)表達(dá)量=該組織CYP19基因表達(dá)量/該組織18S rRNA基因表達(dá)量。

表1 雌性金魚性腺型芳香化酶基因(CYP19A)的表達(dá)所用引物Table 1 Primers used fo r goldfish CYP19A gene cloning and m RNA exp ression analysis

表2 雌性金魚腦型芳香化酶基因(CYP19B)的表達(dá)所用引物Table 2 Primers used for goldfish CYP19B gene cloning and m RNA exp ression analysis

2 結(jié)果

2.1 雌性金魚CYP19A基因的組織表達(dá)

取正常投喂的金魚的卵巢、腦、肝臟、腸、心、脾、頭腎、腎、鰓和肌肉10個(gè)組織,用以上半定量RT-PCR的方法測(cè)定其CYP19A基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,該基因在上述10種組織中都有表達(dá);但只是表達(dá)量有所差異:性腺中表達(dá)最豐富,心臟中最少(見圖1,2)。

2.2 饑餓對(duì)雌性金魚CYP19A基因在腦和卵巢中表達(dá)的影響

隨機(jī)選饑餓5、10和15 d的金魚各3條,取每條魚的腦和性腺2個(gè)組織用以上半定量RT-PCR的方法測(cè)定其CYP19A基因的表達(dá)情況;得出數(shù)據(jù)再同對(duì)照組的結(jié)果相比較,結(jié)果見圖3。對(duì)照組中性腺表達(dá)水平顯著高于腦中(P<0.05),說明性腺型芳香化酶主要在性腺中表達(dá)。CYP19A基因在腦和性腺中的表達(dá)規(guī)律相似:饑餓5 d時(shí)表達(dá)量顯著降低至較低的水平(P<0.05),饑餓期間,表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。

圖1 CYP19A基因m RNA在雌性金魚各組織表達(dá)Fig.1 Them RNA exp ression of CYP19A gene in tissues of female goldfish

圖2 CYP19A基因m RNA在雌性金魚各組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative exp ression level of CYP19A in tissuesof female goldfish

圖3 饑餓脅迫對(duì)雌性金魚CYP19A基因m RNA在腦和卵巢中表達(dá)的影響Fig.3 Effects of starvation stress on relative exp ression level of CYP19A in ovary and brain of goldfish

2.3 雌性金魚CYP19B基因的組織表達(dá)

取正常投喂的金魚的卵巢、腦、肝臟、腸、心、脾、頭腎、腎、鰓和肌肉10個(gè)組織,用以上半定量RT-PCR的方法測(cè)定其CYP19B基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,CYP19B基因僅在以下6種組織中有表達(dá):肌肉、腦、心、頭腎、脾和性腺。表達(dá)量也有差異:腦中表達(dá)最豐富,其余依次為:頭腎、性腺、脾、肌肉和心臟(見圖4,5)。

2.4 饑餓對(duì)雌性金魚CYP19B基因在腦和卵巢中表達(dá)的影響

隨機(jī)選饑餓5、10和15 d的金魚各3條,取每條魚的腦和性腺2個(gè)組織用以上半定量RT-PCR的方法測(cè)定其CYP19B基因的表達(dá)情況;得出數(shù)據(jù)再同對(duì)照組的結(jié)果相比較,結(jié)果見圖6。對(duì)照組中腦表達(dá)水平顯著高于性腺中(P<0.05),說明腦型芳香化酶主要在腦中表達(dá)。CYP19B基因在腦的表達(dá)規(guī)律:饑餓5 d時(shí)表達(dá)量顯著降低至較低的水平(P<0.05),饑餓期間,表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。CYP19B基因在性腺的表達(dá)規(guī)律:饑餓5 d時(shí)表達(dá)量顯著降低至較低的水平(P<0.05);饑餓10～15 d,表達(dá)水平顯著上升(P<0.05),但仍然顯著低于對(duì)照水平(P<0.05)。

圖4 CYP19B基因m RNA在雌性金魚各組織表達(dá)的凝膠成像圖Fig.4 The m RNA exp ression of CYP19B gene in tissues of female goldfish

圖5 CYP19B基因m RNA在雌性金魚各組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative Expression level of CYP19B in in tissues of female goldfish

3 討論

CYP19A基因在金魚卵巢中具有非常高的表達(dá)水平,說明卵巢型芳香化酶主要在性腺中發(fā)揮作用,這與先前在其它魚類所取得的研究結(jié)果是一致的。除性腺外,肝臟內(nèi)的表達(dá)量位居第二,原因可能在于,肝臟中多量的芳香化酶通過促使循環(huán)血液中的雄激素轉(zhuǎn)化為雌二醇,進(jìn)而刺激肝臟合成卵黃蛋白原[4]。腦中的表達(dá)量相對(duì)較低,推測(cè)可能與硬骨魚類2種芳香化酶基因的組織特異性表達(dá)有關(guān),即在腦組織中,表達(dá)量更大、發(fā)揮更多作用的是CYP19B基因。M eital等[19]通過測(cè)定不同卵巢發(fā)育階段的絲足魚2種CYP19基因的表達(dá)水平,認(rèn)為2種芳香化酶在功能上存在差異。李廣麗等研究表明[4],赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelus akaara)雌魚性腺型芳香化酶的表達(dá)量依次是性腺、垂體、鰾、鰓、頭腎、中腦,本研究與該結(jié)果一致,也與金魚[12]、虹鱒(Oncorhynchus m ykiss)[13]、半滑舌鰨(Cynog lossus sem ilaevis)[14]的研究結(jié)果類似。但是徐跑等報(bào)道[15],P450arom A在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)前腦、下丘腦、腦垂體、精巢、肝臟中不表達(dá),只在卵巢中表達(dá),并推測(cè)其對(duì)卵巢發(fā)育起著重要作用,與金魚、赤點(diǎn)石斑魚等表達(dá)規(guī)律不同。M akoto等[20],使用RT-PCR技術(shù)定量分析大西洋庸鰈(H ippog lossus hippog lossus)卵巢型和腦型芳香化酶基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)CYP19A基因在卵巢中表達(dá)量最高,其次為脾臟,在肝臟及心臟中未見表達(dá)。這些不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因,可能在于采樣時(shí)魚體所處生長(zhǎng)發(fā)育階段的不同(是否達(dá)到性成熟、性腺發(fā)育周期),或是魚類的種間差異(不同的產(chǎn)卵類型)。

圖6 饑餓脅迫對(duì)雌性金魚CYP19B基因m RNA在腦和卵巢中表達(dá)的影響Fig.6 Effects of starvation stress on relative exp ression level of CYP19A in ovary and brain of goldfish

CYP19B基因表達(dá)以腦中最多,證明腦型芳香化酶直接參與了腦組織中雌激素的合成;CYP19B在卵巢中表達(dá)量也較高,說明腦型芳香化酶也參與卵巢發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。李廣麗等報(bào)道[4],赤點(diǎn)石斑魚雌魚腦型芳香化酶表達(dá)量在腦組織最高,與本研究結(jié)果相似。徐跑等則發(fā)現(xiàn)[16],P450arom B在腦、卵巢和精巢均有表達(dá),腦部表達(dá)量高于性腺,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致。Tchoudakova和Callard)證實(shí)[17],金魚P450arom B只在腦中表達(dá),在卵巢中沒有檢測(cè)到,可能與性腺發(fā)育期有關(guān)。本研究用于實(shí)驗(yàn)的雌性金魚卵巢發(fā)育期為III期,即正處于卵黃積累時(shí)期,卵巢中2種基因表達(dá)均處于活躍期,與卵巢發(fā)育期吻合。

經(jīng)過饑餓處理5、10、15 d的金魚,其CYP19A和CYP19B基因m RNA在卵巢和腦中的表達(dá)水平,與正常投喂的對(duì)照組相比,均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。但是在3個(gè)饑餓處理組之間,基因表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05),相對(duì)表達(dá)量始終維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平。

雌激素參與性別分化、性腺的生長(zhǎng)和發(fā)育、調(diào)控繁殖行為以及卵黃蛋白原的肝臟合成(Lange等)[21]。而芳香化酶的主要功能是催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。因此,可以推斷在饑餓脅迫條件下,CYP19基因表達(dá)水平顯著降低可能使雌激素合成受阻,并且進(jìn)一步影響卵黃蛋白原的合成以及卵巢組織的發(fā)育。

沈文英等[22]報(bào)道,饑餓延緩了銀鯽卵巢的發(fā)育:饑餓4周以及饑餓2周后再投喂2周的銀鯽,其性腺成熟系數(shù)均顯著低于投喂組;饑餓1～4周其卵徑均顯著低于投喂組,饑餓2周后再投喂2周卵徑仍顯著低于投喂組。任崗等[23]在對(duì)異育銀鯽的研究中發(fā)現(xiàn),處理組饑餓1周,魚體GSI極顯著低于投喂組。在對(duì)血液中SPP和SPC含量測(cè)定后,發(fā)現(xiàn)饑餓2周,導(dǎo)致SPP和SPC含量均極顯著低于投喂組。說明饑餓使異育銀鯽的卵巢發(fā)育受到了抑制。在恢復(fù)投喂后異育銀鯽的GSI、LSI、SPP、SPC含量均有所回升,但仍明顯低于投喂組的水平。

但是,對(duì)于饑餓導(dǎo)致芳香化酶基因表達(dá)水平下降的機(jī)制,目前尚無報(bào)道。推測(cè)金魚在受到饑餓脅迫后,由于缺乏卵巢發(fā)育所必須的營養(yǎng)物質(zhì)、甚至產(chǎn)生發(fā)育停滯退化,從而削弱了機(jī)體對(duì)于雌激素的需求,故導(dǎo)致芳香化酶基因表達(dá)水平下降。若以上假設(shè)成立,則能夠解釋在饑餓后再次投喂產(chǎn)生的補(bǔ)償生長(zhǎng)過程中,卵巢發(fā)育的恢復(fù)滯后于身體生長(zhǎng)的現(xiàn)象[22-23]。也能夠說明,在饑餓脅迫下,魚體處于1種“生存應(yīng)激”狀態(tài)下,盡量抑制繁殖活動(dòng)以安全度過饑餓應(yīng)激時(shí)期。

在本研究中,5 d內(nèi)魚體就能夠及時(shí)調(diào)控內(nèi)分泌并強(qiáng)烈抑制性腺發(fā)育,可能體現(xiàn)了魚體在進(jìn)化上應(yīng)對(duì)饑餓脅迫高度的敏感性和適應(yīng)性。金魚雌魚在饑餓脅迫5 d之后,性腺發(fā)育基本停滯甚至退化,開始分解較成熟卵母細(xì)胞的卵黃囊以維持基本生命活動(dòng)(姜龍,2010年未發(fā)表的數(shù)據(jù))。這一過程可能與芳香化酶活性受到抑制的現(xiàn)象相適應(yīng),因?yàn)榉枷慊傅闹饕δ苁谴龠M(jìn)卵黃積累和卵母細(xì)胞成熟分化,當(dāng)卵巢處在發(fā)育緩慢、停滯和退化的過程中,雌激素的合成受到抑制,卵巢和腦部芳香化酶基因的表達(dá)也經(jīng)過復(fù)雜的調(diào)節(jié)之后被反饋抑制。可見,芳香化酶基因的表達(dá)及其所作用效果,始終受到復(fù)雜而又精密的神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié),這一生理機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

因此,金魚腦型芳香化酶在腦和卵巢中的表達(dá)受到饑餓脅迫后的變化規(guī)律:饑餓5 d時(shí)表達(dá)量顯著降低至較低的水平(P<0.05),隨后表達(dá)水平維持穩(wěn)定。推測(cè)雌魚在饑餓條件下,雌激素合成量銳減,卵巢發(fā)育緩慢甚至停滯,以度過饑餓期。

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