左志晗，鄭津輝

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市細(xì)胞遺傳與分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

擴(kuò)增ccaR基因提高棒狀鏈霉菌克拉維酸產(chǎn)量的研究

左志晗，鄭津輝

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市細(xì)胞遺傳與分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

在棒狀鏈霉菌B71－14中擴(kuò)增對(duì)克拉維酸具有正調(diào)控作用的基因ccaR，構(gòu)建了ccaR的重組質(zhì)粒pSET152－ccaR，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒pSET152－ccaR轉(zhuǎn)入了S.clavuligerusB71－14中，通過(guò)pSET152－ccaR中的att P位點(diǎn)整個(gè)質(zhì)粒插入到S.clavuligerusB71－14基因組中的attB位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了S.clavuligerusB71－14基因組DNA中增加一個(gè)拷貝ccaR基因的目的，所得突變株S.clavuligerus：：ccaR產(chǎn)酸量可達(dá)820.91 mg／L，較出發(fā)菌株提高了54%.

克拉維酸；棒狀鏈霉菌；ccaR［Q812］

克拉維酸是棒狀鏈霉菌的代謝產(chǎn)物，又名棒酸，結(jié)構(gòu)式如下.

其本身抗菌活性很弱，但具有強(qiáng)力、廣譜且不可逆的β－內(nèi)酰胺酶抑制活性.大量體外抗菌作用研究表明，β－內(nèi)酰胺酶抑制劑與β－內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)后者的抗菌活性.

由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致很多細(xì)菌產(chǎn)生了抗藥性，這己成為臨床上治療細(xì)菌性疾病的一個(gè)越來(lái)越棘手的問(wèn)題.克拉維酸同β－內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用既抑制了β－內(nèi)酰胺酶的活性，又增強(qiáng)了這類抗生素的廣譜抗菌作用，可有效解決產(chǎn)酶細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題.但當(dāng)前我國(guó)臨床上使用的復(fù)方β－內(nèi)酰胺類抗生素來(lái)源主要依賴進(jìn)口產(chǎn)品，其主要原因是菌株的產(chǎn)酸能力差，因此如何獲取高產(chǎn)菌株是解決這種現(xiàn)狀的關(guān)鍵.隨著鏈霉菌分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及克拉維酸代謝途徑和相應(yīng)基因簇的進(jìn)一步揭示，通過(guò)基因工程的手段來(lái)獲取高產(chǎn)菌株已成為可能［1］.

目前，克拉維酸生物合成途徑的基因簇己經(jīng)被闡釋.克拉維酸合成具有獨(dú)立的代謝途徑，它以D－3－磷酸甘油醛和精氨酸為前體物質(zhì)［2］，依次在ceaS，bls，pah，cas和oat等基因編碼酶的作用下合成，Kapil等［3］研究還發(fā)現(xiàn)參與克拉維酸生物合成的上述基因均具有與之相似的同源基因，且相互同源的基因分別集中在兩套平行的基因簇內(nèi)：一套包括ceaS1，bls1，pah1 和oat1 等 基 因；另 一 套 包 括ceaS2，bls2，pah2，cas2和oat2等基因，且兩套基因簇中的基因排列順序非常相似.

除上述基因外，在棒狀鏈霉菌中，抗生素及克拉維酸的合成受到按級(jí)別排列的一系列基因的調(diào)控，故某些調(diào)控基因的變化可能會(huì)使克拉維酸產(chǎn)量獲得提高［4］.

ccaR是棒狀鏈霉菌克拉維酸生物合成的調(diào)節(jié)基因之一，位于棒狀鏈霉菌頭霉素C基因簇lat基因下游4 kb處，編碼由256個(gè)氨基酸組成的類ActII－ORF－4調(diào)控蛋白.ccaR的作用是結(jié)合于cefD－cmcl基因之間的雙向啟動(dòng)子上，對(duì)于頭霉素C和克拉維酸生成途徑的中、下游所需要酶的轉(zhuǎn)錄過(guò)程起到調(diào)節(jié)作用.它還可以結(jié)合在自身的啟動(dòng)子上，是一個(gè)正調(diào)節(jié)因子.ccaR的突變將導(dǎo)致頭霉素C和克拉維酸或其它棒烷類合成的停止；當(dāng)回補(bǔ)ccaR基因后，頭霉素C和克拉維酸的合成得以恢復(fù)；盡管頭霉素C和克拉維酸這兩個(gè)β－內(nèi)酰胺類物質(zhì)的合成途徑截然不同，但當(dāng)增加ccaR拷貝數(shù)后，頭霉素C和克拉維酸的產(chǎn)量都將成倍增加［5］.

本研究選取棒狀鏈霉菌的ccaR為目標(biāo)基因，構(gòu)建了含ccaR基因的重組質(zhì)粒pSET152－ccaR，對(duì)棒狀鏈霉菌的ccaR基因進(jìn)行了擴(kuò)增，并對(duì)所得的突變菌株的克拉維酸產(chǎn)量變化進(jìn)行了研究.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及培養(yǎng)基

棒狀鏈霉菌S.clavuligerusB71－14（紫外誘變獲得的克拉維酸高產(chǎn)菌株），用于接合轉(zhuǎn)移的E.coliET12567／p UZ8002以及E.coliDH5α均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種.

PCR產(chǎn)物克隆載體 p UCm－T（AmpR），購(gòu)自Sangon公司；大腸桿菌 －放線菌穿梭質(zhì)粒載體pSET152，含有接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)（RK2ori T）、阿泊拉霉素抗性基因（aacC4）和特異整合位點(diǎn)att P，由加拿大阿爾伯塔大學(xué)Annie教授惠贈(zèng).

E.coliET12567／p UZ8002 以 及E.coliDH5α所用為L(zhǎng)B培養(yǎng)基［6］；棒狀鏈霉菌所用產(chǎn)孢培養(yǎng)基為YMGA培養(yǎng)基［7］，種子培養(yǎng)采用TSB培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)采用SS培養(yǎng)基［8］.大腸桿菌－鏈霉菌接合培養(yǎng)基采用改良 AS－1培養(yǎng)基（g／L）［9］，即在每升AS－1培養(yǎng)基中添加5 g蛋白胨及0.5 g葡萄糖.

以上所用培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)帶有質(zhì)粒的抗性菌株時(shí)培養(yǎng)基中抗生素的使用濃度如下：氨芐青霉素終質(zhì)量濃度為100μg／m L，阿泊拉霉素為25μg／m L，卡那霉素為50μg／m L，氯霉素為25μg／m L，萘啶酮酸為25μg／m L.

1.2 DNA體外重組

大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的提取、限制性內(nèi)切酶消化、連接、PCR以及轉(zhuǎn)化等操作均按Sambrook等［10］的方法進(jìn)行.

棒狀鏈霉菌中質(zhì)粒及染色體的提取按Kieser等［8］的方法進(jìn)行.

1.3 cca R的測(cè)序

以ccaR的上下游引物做測(cè)序引物，采用Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序反應(yīng)委托Sangon公司完成.測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行序列比對(duì)（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）.

1.4 重組質(zhì)粒向S.clavuligerus B71－14的轉(zhuǎn)移

重組質(zhì)粒向S.clavuligerusB71－14的轉(zhuǎn)移采用Kieser等［8］介紹的接合轉(zhuǎn)移的方法，即以E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR 為 供 體 菌 株，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至S.clavuligerusB71－14中.

1.5 發(fā)酵液中克拉維酸的生物檢測(cè)及HPLC分析

以克雷伯氏肺炎桿菌KlabsiellapneumoniaeATCC29665作為克拉維酸生物活性鑒定指示菌［11］.

發(fā)酵液于10 000 r／min離心10 min，所得上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，按1∶5的比例與咪唑溶液混勻，30℃反應(yīng)12 min后冷卻到20℃，生成的衍生物采用Shim－pack VP－ODS（150×4.6）C18色譜柱進(jìn)行 HPLC分析［12］.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 cca R基因的獲得

將ccaR的測(cè)序結(jié)果在GenBank上做序列比對(duì)，結(jié)果證明，PCR獲得的ccaR與棒狀鏈霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NRRL 3585具有99.93%的同源性，證明所得的PCR產(chǎn)物正確，可以用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建.

2.2 重組質(zhì)粒pSET152－cca R的構(gòu)建

參照文獻(xiàn)［13］報(bào)道的棒狀鏈霉菌調(diào)節(jié)基因ccaR的相應(yīng)核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成如下引物（引物委托北京奧科生物工程有限公司合成）：引物1：5’－TAGGGAGGGGAGAGTCCGA－3’； 引 物 2： 5 ’－TTCAGCGTTGGTTCAGGGA－3’.以棒狀鏈霉菌的染色體為模板，PCR擴(kuò)增得到1.4 kb的一段含上游啟動(dòng)區(qū)的ccaR基因片段，將該片段經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化與p UCm－T載體進(jìn)行連接，得到重 組 質(zhì) 粒 p UCm－T－ccaR；對(duì) p UCm－T－ccaR 進(jìn) 行EcoRI－BamHI酶切，回收1.4 kb的ccaR 基因片段，與經(jīng)過(guò)同樣酶切的載體pSET152進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)質(zhì)粒提取，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，載體的構(gòu)建過(guò)程及驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2.

圖1 重組質(zhì)粒pSET152－cca R的構(gòu)建過(guò)程Figure 1 Construction of the recombinant plasmid pSET152－cca R

圖2 重組質(zhì)粒pSET152－cca R的驗(yàn)證Figure 2 Verification of recombinant plasmid pSET152－cca R

由圖2可知，采用EcoRI酶切pSET152－ccaR后得到一條1.4 kb的DNA片段和一條5.5 kb的DNA片段，分別與ccaR基因及載體pSET152的大小相吻合，與理論值相符.并且以待驗(yàn)證的pSET152－ccaR質(zhì)粒為模版，PCR擴(kuò)增ccaR基因的引物和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果能得到1.4 kb的ccaR基因片段，表明此重組質(zhì)粒為正確的重組質(zhì)粒pSET152－ccaR.

2.3 pSET152－cca R向棒狀鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移

將驗(yàn)證正確的pSET152－ccaR電轉(zhuǎn)至E.coliET12567／p UZ8002 中，所 得 的 轉(zhuǎn) 化 子E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR 與S.clavuligerusB71－14進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，從AS－1培養(yǎng)基中挑取單個(gè)接合子至含有萘啶酮酸（25μg／m L）和阿泊拉霉素（25μg／m L）的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，再影印至含有和不含有卡那霉素（50μg／m L）的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上.最后，挑選出抗阿泊拉霉素但對(duì)卡那霉素敏感的菌株即為接合子.提取接合子中的質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與由大腸桿菌中所提取的質(zhì)粒相一致，表明重組質(zhì) 粒 pSET152－ccaR 已 轉(zhuǎn) 入S.clavuligerusB71－14中.

2.4 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

載體pSET152含有一個(gè)att P位點(diǎn)，可以特異性地插入到鏈霉菌基因組中的att B位點(diǎn)，重組質(zhì)粒pSET152－ccaR 轉(zhuǎn)入S.clavuligerusB71－14后，將以整合到基因組上的插入方式將其攜帶的ccaR同時(shí)插入到S.clavuligerusB71－14的attB位點(diǎn)（圖3），從而使其增加了一個(gè)拷貝的ccaR基因.

圖3 pSET152－cca R 插入 S.clavuligerus B71－14染色體的示意圖Figure 3 Procedure of pSET152－cca R inserted intochromosome of S.clavuligerus B71－14

將上述接合平板上長(zhǎng)出的阿泊拉抗性菌落轉(zhuǎn)接于含相應(yīng)抗生素的YMGA平板上，28℃培養(yǎng)3～5 d，直至孢子出現(xiàn)，收集孢子，將孢子在不含抗生素的YMGA培養(yǎng)基上進(jìn)行松弛培養(yǎng)，并在該培養(yǎng)基上傳代3次，仍具有抗性的菌株即為插入了重組質(zhì)粒pSET152－ccaR的菌株，將該突變株命名為S.clavuligerus：：ccaR.

根據(jù)棒狀鏈霉菌attB位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)一對(duì) 引 物 （圖 4）P1：5’－AGCGGCCAAAGGGAGCAGACTGTAA－3’；P2：5’－CAGGATTCGAACCTGGGAAGGCTGA－3’，分別以S.clavuligerus：：ccaR及出發(fā)菌株S.clavuligerusB71－14的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖4.

由圖4可知，以S.clavuligerus：：ccaR的基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物在6～7 kb之間，與理論值6.9 kb（6.9 kb的pSET152－ccaR插入S.clavuligerus的attB位點(diǎn)）相吻合；而以出發(fā)菌株S.clavuligerusB71－14的基因組DNA為模板不能得到PCR產(chǎn)物（att B兩引物之間只有60 bp），說(shuō)明S.clavuligerus：：ccaR為pSET152－ccaR整合插入到S.clavuligerusB71－14的attB位點(diǎn)所得的突變株.

圖4 突變株S.clavuligerus：：cca R的PCR驗(yàn)證Figure 4 PCR verification of S.clavuligerus：：cca R

2.5 S.clavuligerus：：cca R產(chǎn)酸能力的測(cè)定

挑取突變菌株及一株原始對(duì)照菌株在豆粉培養(yǎng)基中分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液中的克拉維酸含量，結(jié)果突變菌株的克拉維酸產(chǎn)量最高（表1中M－1）可達(dá)820.91 mg／L，較原始對(duì)照菌株提高了54%（表1）.

表1 突變菌株及原始菌株發(fā)酵液中克拉維酸產(chǎn)量的HPLC測(cè)定結(jié)果Table 1 HPLC analysis result of clavulanic acid production of original strain and the mutants

2.6 S.clavuligerus：：cca R的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將表1中產(chǎn)酸量最高的突變株M－1在YMGA培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每轉(zhuǎn)接一次同時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵后HPLC法測(cè)定克拉維酸的效價(jià)，結(jié)果如表2所示.

表2 S.clavuligerus：：cca R的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Hereditary stability of S.clavuligerus：：cca R

由表2的傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，S.clavuligerus：：ccaR在5代之內(nèi)產(chǎn)酸量較穩(wěn)定，繼續(xù)傳代，則菌種的產(chǎn)酸量下降較明顯，所以應(yīng)盡量控制傳代次數(shù)在5代以內(nèi).

3 結(jié)果與討論

隨著克拉維酸生物合成途徑及基因調(diào)控的逐漸明確，在常規(guī)誘變、原生質(zhì)體融合的基礎(chǔ)上可以寄希望于通過(guò)基因工程的方法來(lái)獲得克拉維酸高產(chǎn)菌株［4］.

頭霉素C是棒狀鏈霉菌的抗生素類代謝產(chǎn)物之一，與克拉維酸的代謝途徑彼此獨(dú)立又關(guān)系密切，克拉維酸合成酶基因簇和頭霉素C合成酶基因簇相鄰，且受相同的調(diào)節(jié)基因ccaR的調(diào)控，而棒狀鏈霉菌中一種代謝產(chǎn)物的阻斷往往會(huì)導(dǎo)致其它代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高［14］.基于上述原因，Paradkar等［15］對(duì)野生型棒狀鏈霉菌的lat基因進(jìn)行插入突變，該基因編碼賴氨酸ε－轉(zhuǎn)氨酶（該酶是頭霉素C合成途徑中的關(guān)鍵酶）［16］，結(jié)果獲得了頭霉素C合成停止而克拉維產(chǎn)酸量為原始菌株的2.5倍的高產(chǎn)菌株，是采用基因工程的方法對(duì)棒狀鏈霉菌進(jìn)行改造的成功典范.國(guó)內(nèi)王永華［17］、舒楊等［18］也曾采用類似的方法分別獲得了克拉維酸產(chǎn)量分別為原始菌株1.8倍和2.67倍的高產(chǎn)突變株.

本課題曾選擇對(duì)棒狀鏈霉菌進(jìn)行紫外誘變獲得了產(chǎn)量為原始菌株1.91倍的高產(chǎn)菌株S.clavuligerusB71－14［19］，并對(duì)該誘變高產(chǎn)菌株進(jìn)行了lat基因的插入突變，獲得了產(chǎn)酸量進(jìn)一步提高的工程菌株［20］.在前面研究的基礎(chǔ)上，本研究嘗試在高產(chǎn)菌株S.clavuligerusB71－14中擴(kuò)增對(duì)克拉維酸合成具有正調(diào)控作用的調(diào)節(jié)基因ccaR，以期為構(gòu)建棒狀鏈霉菌高產(chǎn)菌株提供又一可行途徑.

本實(shí)驗(yàn)嘗試增加棒狀鏈霉菌中的ccaR基因拷貝以提高克拉維酸的產(chǎn)量，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSET152－ccaR，并將其轉(zhuǎn)入E.coliET12567中獲得了接合轉(zhuǎn)移的供體菌E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR，通過(guò)大腸桿菌與棒狀鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)成功的將重組質(zhì)粒pSET152－ccaR轉(zhuǎn)入了S.clavuligerusB71－14中，由于載體pSET152含有一個(gè)att P位點(diǎn)，可以特異性的插入到鏈霉菌基因組中的att B位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了在S.clavuligerusB71－14基因組中增加一個(gè)拷貝ccaR基因的目的，該方式是整合到基因組上的插入方式，所構(gòu)建的基因工程菌株穩(wěn)定性較高，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，為棒狀鏈霉菌克拉維酸高產(chǎn)菌的選育提供了又一可行性途徑.

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Study on application ofccaRStreptomycesclavuligerusto increase clavulanic acid production

ZUOZhihan，ZHENGJinhui

（a.College of Life Science，b.Tianjin Key Laboratory of Cyto－Genetical and Molecular Regulation，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Clavulanic acid positive regulation geneccaR was amplified inStreptomycesclavuligerusB71－14.ccaR expression plasmid pSET152－ccaR was constructed and transformed intoS.clavuligerusB71－14 by conjugation.Theatt Psite in pSET152－ccaR could be inserted intoattBsite ofS.clavuligerusB71－14，and an extra copy ofccaR was inserted into the chromosome ofS.clavuligerusB71－14.The clavulanic acid yield of the obtained mutantS.clavuligerus：：ccaR can reach 820.91 mg／L，which is 1.54 times of that withS.clavuligerusB71－14.The yield is steady within five generations.

clavulanic acid；Streptomycesclavuligerus；ccaR

Q939.9

A

1671－1114（2011）04－0064－06

2010－04－07

天津師范大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目（52X0910）

左志晗（1979），女，講師，博士，主要從事微生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)方面的研究.

（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）