郭永明，梁憲如

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸系，天津 300193；2.武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300162）

白介素-8（IL-8）是20世紀(jì)80年代后期發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)炎性細(xì)胞具有趨化作用的細(xì)胞因子，在炎性反應(yīng)及缺血性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。局灶性腦缺血后缺血側(cè)腦組織發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，IL-8作為一種重要的炎性細(xì)胞因子，在這一病理生理過(guò)程中如何變化、發(fā)揮什么作用，針刺對(duì)其有何影響呢？本次實(shí)驗(yàn)用放免法動(dòng)態(tài)觀察了局灶性腦缺血大鼠腦組織及外周血IL-8的變化及針刺的干預(yù)效應(yīng)，旨在進(jìn)一步探討腦缺血后炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制及針刺治療腦缺血的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用Wistar大鼠130只（由天津市衛(wèi)生局實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量（220±20）g，雌雄各半，隨機(jī)分缺血組、針刺組各50只、假手術(shù)組25只、正常組5只。前3組又分為3、6、12、24、48h各時(shí)段組，其中缺血組、針刺組每組各10只、假手組每組各5只。

1.2 模型的制作 缺血組及針刺組動(dòng)物經(jīng)3%的戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，側(cè)臥位固定，于眼眶至耳的中點(diǎn)縱行切開(kāi)皮膚約1 cm左右，分離并切去部分顳肌，暴露顳骨，做一個(gè)約3 mm的骨窗，輕抬腦，可見(jiàn)橫過(guò)嗅束向上走行的大腦中動(dòng)脈（MCA），用加熱的不銹鋼絲輕輕接觸靠近嗅束上緣的大腦中動(dòng)脈，使之快速凝閉，遇有血管破裂可用小棉球局部輕壓止血，術(shù)后創(chuàng)面敷少許抗生素（先鋒Ⅳ），縫合傷口并單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不凝閉MCA外，余手術(shù)步驟同模型組。

1.3 腧穴的選取及處理 根據(jù)大鼠穴位圖譜，針刺組選取“醒腦開(kāi)竅”針?lè)ㄖ餮ㄈ酥?、?nèi)關(guān)，先針刺人中，用雀啄手法10次，繼刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，直刺捻轉(zhuǎn)提插瀉法1 min。3 h針刺組，手術(shù)后1 h針刺；6、12 h針刺組，手術(shù)后1 h針刺，處死前蓄積1次；24、48 h針刺組針2次/d，處死前蓄積1次。正常組、假手術(shù)組及缺血各組動(dòng)物同樣抓取，不做其他處理。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.4.1 標(biāo)本收集 各組動(dòng)物在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)摘眼球取血，分離血清，-20℃冰箱保存，待測(cè)。然后迅速斷頭取腦，在冰盤上分開(kāi)兩大腦半球，剝離大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）側(cè)皮質(zhì)，稱質(zhì)量，按 400 mg：1 mL 的比例加生理鹽水作組織勻漿，2000 r/min離心15 min，取上清，-20℃冰箱保存，待測(cè)。

1.4.2 IL-8 的測(cè)定 采用 FT-6 SDF γ-晶體閃爍計(jì)數(shù)儀（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院放免室提供），用放射免疫分析法測(cè)定各組動(dòng)物腦組織及血清中IL-8含量，IL-8檢測(cè)試劑盒由北京東亞免疫技術(shù)研究所提供，操作程序嚴(yán)格按照藥盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 局灶性腦缺血大鼠腦組織IL-8含量的變化及針刺的影響 局灶性腦缺血后3 h腦組織IL-8含量明顯升高，12 h達(dá)高峰，然后逐漸降低，至48 h仍維持在較高水平，各時(shí)段模型組與同時(shí)段假手術(shù)組及正常組比較均具有顯著性差異（P＜0.01），各時(shí)段假手術(shù)組與正常組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。治療后3 h針刺組腦組織IL-8含量較模型組略有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），6～48 h各時(shí)段針刺組與同時(shí)段模型組比較腦組織IL-8含量明顯降低（P＜0.01），與同時(shí)段假手術(shù)組及正常組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明局灶性腦缺血后腦組織IL-8含量明顯增高，“醒腦開(kāi)竅”針?lè)稍谌毖缙冢? h）明顯抑制腦組織IL-8含量升高，并持續(xù)至48 h使其含量基本維持在正常范圍。各組動(dòng)物腦組織IL-8含量變化見(jiàn)表1。

表1 各組動(dòng)物腦組織白介素-8含量(±sTab.1 The content of IL-8 in the brain of all groups of rats(±sμg/g

表1 各組動(dòng)物腦組織白介素-8含量(±sTab.1 The content of IL-8 in the brain of all groups of rats(±sμg/g

注：與同時(shí)段模型組比較：※P＜0.05，※※P＜0.01；與同時(shí)段假手術(shù)組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01；與正常組比較：▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。

組別模型組針刺組假手術(shù)組正常組3 h 3.225±0.639▼▼★★2.787±0.504▼▼★★1.310±0.4351.044±0.5396 h 3.370±0.765▼▼★★0.885±0.669※※1.072±0.2801.044±0.53912 h 3.480±0.892▼▼★★0.610±0.543※※1.048±0.1451.044±0.539組別模型組針刺組假手術(shù)組正常組24 h 3.135±0.808▼▼★★0.870±0.508※※1.148±0.5801.044±0.53948 h 2.875±0.540▼▼★★1.090±0.641※※0.814±0.2971.044±0.539

2.2 局灶性腦缺血大鼠血清IL-8含量的變化及針刺的影響 局灶性腦缺血后各時(shí)段模型組血清IL-8含量較同時(shí)段假手術(shù)組和/或正常組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），治療后 6、12及 48 h針刺組血清IL-8含量顯著低于同時(shí)段模型組（P＜0.05，P＜0.01），表明局灶性腦缺血后血清IL-8含量升高，“醒腦開(kāi)竅”針?lè)墒蛊浜拷档?。各組動(dòng)物血清IL-8含量變化見(jiàn)表2。

表2 各組動(dòng)物血清白介素-8含量(±sTab.2 The content of IL-8 in the serum of all groups of rats(±sμg/L

表2 各組動(dòng)物血清白介素-8含量(±sTab.2 The content of IL-8 in the serum of all groups of rats(±sμg/L

注：與同時(shí)段模型組比較：※P＜0.05，※※P＜0.01；與同時(shí)段假手術(shù)組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01；與正常組比較：▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。

組別模型組針刺組假手術(shù)組正常組3 h 0.708±0.413▼0.571±0.2270.482±0.1890.408±0.2746 h 0.827±0.218▼▼★0.485±0.253※※0.498±0.0920.408±0.27412 h 0.769±0.197▼★0.535±0.249※0.432±0.1320.408±0.27424 h 0.806±0.421▼▼★0.769±0.225▼0.492±0.1180.408±0.27448 h 0.961±0.293▼▼★★0.635±0.222※※0.404±0.0780.408±0.274

3 討論

IL-8是一種重要的白細(xì)胞趨化因子，可由許多細(xì)胞產(chǎn)生，主要吸引中性粒細(xì)胞、噬酸粒細(xì)胞、噬堿粒細(xì)胞及T細(xì)胞[1]，腦內(nèi)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞受IL-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的刺激亦可誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生[2]。IL-8屬于一類典型的炎性介質(zhì)，可在炎癥反應(yīng)過(guò)程中趨化中性粒細(xì)胞，使細(xì)胞表達(dá)黏附分子，導(dǎo)致細(xì)胞游離Ca2+濃度迅速而短暫升高，并誘導(dǎo)細(xì)胞變形、脫顆粒反應(yīng)、呼吸爆發(fā)和溶酶體酶釋放，使細(xì)胞得以激活[3]；IL-8不僅在白細(xì)胞趨化中起關(guān)鍵作用，而且和IL-8相關(guān)趨化性多肽能在幾分鐘內(nèi)快速活化整合素α、β鏈的連接分子，增加白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和跨膜移行[4]，因此，IL-8在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。

研究表明，腦缺血時(shí)腦組織及外周血中IL-8發(fā)生明顯改變，Kostulas等[5]通過(guò)原位雜交法測(cè)定發(fā)病1～7 d的腦缺血患者單核細(xì)胞內(nèi)IL-8 mRNA的表達(dá)，并用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定血漿中IL-8水平，發(fā)現(xiàn)缺血性卒中患者單核細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)增加，血漿中IL-8水平升高，兩者呈正相關(guān)，認(rèn)為多形核白細(xì)胞（PMNL）由血循環(huán)到達(dá)腦缺血部位可能與IL-8有關(guān),IL-8可能參與了白細(xì)胞向缺血損傷部位聚集的反應(yīng)。潘旭東[6]等采用雙抗體夾心法間接ELISA法觀察了缺血性腦血管病（ICVD）患者血清IL－8水平的變化，發(fā)現(xiàn)ICVD患者血清IL－8高于正常人，發(fā)病1周內(nèi)高于1周后，大面積腦梗死者高于小面積腦梗死者，提示IL-8與腦缺血損傷有關(guān)，它與腦缺血病程呈負(fù)相關(guān)，與梗死面積呈正相關(guān)，說(shuō)明腦缺血損傷引起IL-8水平的升高，而IL-8水平的升高又加重腦損傷的程度。其他學(xué)者[7-10]也有類似報(bào)道，認(rèn)為IL-8在“缺血-炎癥/免疫反應(yīng)-缺血或出血發(fā)生-再缺血”這一循環(huán)過(guò)程中具有關(guān)鍵的觸發(fā)作用，是神經(jīng)系統(tǒng)損傷免疫機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，早期IL-8增高提示預(yù)后不良。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦缺血后腦組織及血清IL-8含量顯著增高，以腦組織中增高尤為明顯，各時(shí)段平均增高幅度達(dá)到3倍左右，該結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，推測(cè)缺血后缺血皮質(zhì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌IL-1β、TNF-α迅速增加，從而激活神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等分泌合成大量IL-8，導(dǎo)致缺血早期腦內(nèi)及血清IL-8含量急劇增高，IL-8與其他炎性細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α等共同作用，快速活化整合素α、β鏈的連接分子，并誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子（ICAM-1）等黏附分子表達(dá)上調(diào)，由此造成白細(xì)胞與缺血區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞的牢固黏附，加之缺血局部存在高濃度的IL-8，因此不斷趨化吸引炎性細(xì)胞穿越血管壁，進(jìn)入腦組織并向周圍浸潤(rùn)，進(jìn)入腦組織的炎性細(xì)胞又合成分泌大量IL-8，由此進(jìn)一步造成缺血側(cè)腦組織IL-8持續(xù)增高。筆者認(rèn)為缺血側(cè)腦組織IL-8的升高既是形成炎性反應(yīng)的始動(dòng)因素之一，同時(shí)又是炎性反應(yīng)的結(jié)果，而血清中IL-8含量的高低可能間接反應(yīng)腦損害的程度。針刺后腦組織及血清中IL-8含量顯著降低，尤以腦組織中IL-8降低更為明顯，說(shuō)明針刺可通過(guò)減少IL-8的合成分泌而抑制炎性細(xì)胞的黏附及浸潤(rùn)，阻斷由IL-8所介導(dǎo)的一系列炎癥反應(yīng)的發(fā)展，從發(fā)揮腦保護(hù)作用，推測(cè)對(duì)IL-8這種顯著的良性調(diào)整作用可能是“醒腦開(kāi)竅”針?lè)ㄖ委熑毖阅X血管疾病的重要作用機(jī)制之一。

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