邢福珊,許信剛,童德文,王志昇,張彥明

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌712100)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。PCV2可以引起斷奶仔豬發(fā)生衰竭、死亡,還與仔豬先天性震顫(CT)、成年豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)和呼吸道疾病綜合征(PRDS)有關(guān)。PCV2基因組為環(huán)狀、單鏈DNA,全長(zhǎng)1 767 bp～1 768 bp,PCV2基因組含有11個(gè)ORF,分別命名為ORF1～ORF11。研究表明,ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白(Cap),是主要的免疫原,能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[1],對(duì)豬圓環(huán)病毒疫苗的研究有較大的意義。桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞的吸附和侵入與病毒的囊膜糖蛋白gp64有重要關(guān)系。gp64由N-末端信號(hào)肽和成熟蛋白(跨膜區(qū)TM和胞質(zhì)區(qū)CTD)組成[1]。gp64被開(kāi)發(fā)成桿狀病毒表面展示系統(tǒng)來(lái)展示不同的目的蛋白,外源基因片段插入到病毒囊膜蛋白的信號(hào)肽與成熟蛋白之間,表達(dá)加工時(shí)信號(hào)肽被切除,形成的N端融合蛋白借助桿狀病毒穩(wěn)定地表達(dá)并展示于感染細(xì)胞或病毒粒子的表面,篩選得到表達(dá)有目的蛋白的重組桿狀病毒。目前,桿狀病毒表面展示系統(tǒng)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)用于進(jìn)行基因工程亞單位疫苗的研制[2-3]。本試驗(yàn)基于Cap蛋白是PCV2的主要免疫原,以桿狀病毒表面展示系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒,免疫金電子顯微鏡檢測(cè)重組Cap蛋白在桿狀病毒的囊膜上進(jìn)行了展示,為進(jìn)一步研究豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、病毒和細(xì)胞 含有PCV2 ORF2基因的質(zhì)粒pGEM-ORF2由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離/克隆并保存;pGEM-T購(gòu)自 Promega公司;表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC、Sf9細(xì)胞、大腸桿菌 DH 10Bac(Gibco-BRL)、大腸桿菌DH5α由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 主要試劑 PCV2陽(yáng)性血清由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心惠贈(zèng);HRP標(biāo)記羊抗豬IgG、膠體金標(biāo)記的兔抗豬IgG,Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司;各種內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA多聚酶、d NTP購(gòu)自Promega公司;昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基TNM-FH購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清GIBCOBRL公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自于解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.4 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒p BacSC-ORF2的構(gòu)建和篩選以pGEM-ORF2為模板,PCR擴(kuò)增ORF2基因。上游引物P1 5′-GCTCTCGAGATGAATGGCATC TTC-3′(下劃線為 Xho I酶切位點(diǎn)),下游引物 P2 5′-GGGCTGCAGAAGTGGGGGGTCTTTAAG-3′(下劃線為Pst I酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增片段為579 bp,擴(kuò)增的片段為缺失N端的41個(gè)氨基酸的核定位信號(hào)區(qū)的ORF2基因。PCR產(chǎn)物雙酶切回收后定向插入轉(zhuǎn)座載體p BacSC的限制性酶切位點(diǎn)處,得到重組轉(zhuǎn)座載體p BacSC-ORF2。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α工程菌,進(jìn)行篩選鑒定,并對(duì)重組質(zhì)粒中的ORF2基因進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 重組桿狀病毒的獲得與鑒定 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座、DH 10Bac陽(yáng)性菌落的篩選與純化、重組桿狀病毒DNA的提取、轉(zhuǎn)染、PCR模板的制備、重組病毒的擴(kuò)增、病毒滴度測(cè)定均按照Invitrogen公司Bacto-Bac表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)進(jìn)行。以上過(guò)程均以不含ORF2基因的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC作為陰性對(duì)照。重組蛋白桿狀病毒命名為 BacSC-ORF2,而不含ORF2基因轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC得到的重組桿狀病毒命名為BacSC。

1.6 重組桿狀病毒的純化及Western-blot檢測(cè)重組病毒感染Sf9細(xì)胞,收獲重組桿狀病毒。病毒的純化用蔗糖密度梯度超速離心法,具體參考文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行,純化后的病毒進(jìn)行 Western-blot檢測(cè)分析。第一抗體為豬抗PCV2陽(yáng)性血清(1∶500),第二抗體為 HRP標(biāo)記羊抗豬 IgG(1∶4 000)。最后暗房進(jìn)行底物化學(xué)發(fā)光(ECL)法反應(yīng),膠片顯影分析。

1.7 重組桿狀病毒的免疫電鏡(IEM)分析 純化的重組桿狀病毒進(jìn)行免疫電鏡分析,具體操作參考文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。第一抗體為豬抗PCV2陽(yáng)性血清(1∶100),第二抗體為膠體金標(biāo)記兔抗豬 IgG(1∶100)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建和篩選 重組質(zhì)粒p BacSC-ORF2經(jīng)雙酶切后得到大約6 800 bp和579 bp 2個(gè)片段,分別與載體和去掉核定位信號(hào)區(qū)ORF2基因長(zhǎng)度一致(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明,載體p BacSC和ORF2基因接頭連接處正確,大小和讀碼框架正確完整。

圖1 重組質(zhì)粒p BacSC-ORF2的酶切鑒定

2.2 重組桿狀病毒的獲得 重組轉(zhuǎn)座載體p Bac-SC-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 10Bac進(jìn)行同源重組,經(jīng)過(guò)“三抗”平板3輪篩選,然后提取重組DNA,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染 Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染3 d后,Sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE變化,細(xì)胞裂解、死亡,說(shuō)明產(chǎn)生了具有感染活性的重組桿狀病毒。

2.3 重組桿狀病毒的Western-blot檢測(cè)重組桿狀病毒純化后Western-blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn),抗PCV2陽(yáng)性血清檢測(cè)到大約為 27 ku的Cap蛋白,表明 Cap蛋白在重組桿狀病毒中成功表達(dá)。

2.4 免疫電鏡分析Cap蛋白在桿狀病毒囊膜上的展示 免疫電鏡分析結(jié)果見(jiàn)圖4,金粒子結(jié)合到重組桿狀病毒的囊膜上(圖4B,箭頭所示),而陰性重組桿狀病毒對(duì)照組沒(méi)有金粒子結(jié)合(圖4A),表明Cap蛋白在重組桿狀病毒囊膜上得到展示。

圖2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后出現(xiàn)的CPE

圖3 Western-blot分析純化重組桿狀病毒

圖4 免疫電鏡分析Cap蛋白在重組桿狀病毒囊膜上的展示

3 討論

目前PCV2在世界范圍內(nèi)廣泛存在,由其引發(fā)的疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2商品化疫苗主要有全病毒滅活苗和亞單位疫苗,在我國(guó)還未見(jiàn)關(guān)于防治該病疫苗已商品化的報(bào)道。由于體外培養(yǎng)PCV 2比較困難,病毒培養(yǎng)成本高、周期長(zhǎng)[5],因此發(fā)展傳統(tǒng)的滅活疫苗前景不大,亞單位疫苗是PCV2疫苗研究的方向[5],但是傳統(tǒng)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)只能分泌到培養(yǎng)基上清中,目的蛋白的純化非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力,純化費(fèi)用昂貴,不能大規(guī)模化生產(chǎn)。人們迫切希望找到一種同時(shí)提供表達(dá)量大、蛋白活性高、易于純化、易于規(guī)?；a(chǎn)的新型疫苗來(lái)預(yù)防和控制PCV2的流行。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)可以用來(lái)解決目的蛋白純化代價(jià)昂貴、程序復(fù)雜的問(wèn)題。用桿狀病毒表面展示系統(tǒng)生產(chǎn)目的蛋白,純化過(guò)程特別簡(jiǎn)單,只需要超速離心得到重組桿狀病毒即可同時(shí)獲得目的蛋白,純化費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)單、可以規(guī)?；a(chǎn),解決目前蛋白純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力,代價(jià)昂貴的現(xiàn)狀[6]。

PCV2的ORF2基因編碼病毒的核衣殼(Cap)蛋白具有良好的免疫原性,是構(gòu)建重組疫苗的首選基因。本試驗(yàn)將PCV2 Cap蛋白插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體中,感染Sf9細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒BacSC-ORF2。用重組病毒BacSC-ORF2感染Sf9細(xì)胞后,收獲重組桿狀病毒,進(jìn)行Western-blot檢測(cè),能夠檢測(cè)到Cap蛋白的表達(dá)。免疫膠體金電子顯微鏡檢測(cè)更直接的觀察到金粒子展示在重組桿狀病毒的囊膜上,這說(shuō)明Cap蛋白最終是定位展示在重組桿狀病毒粒子囊膜上。表面展示有PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒的成功構(gòu)建,為豬圓環(huán)病毒病基因工程亞單位疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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