尹 朋,趙 燁,朱曉宇,王 寧,劉鳳華,許劍琴,胡艷欣

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京海淀100193;2.北京農(nóng)學院動物科技系,北京昌平102206)

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為,脾為后天之本,主運化,為氣血生化之源,現(xiàn)代研究認為,脾(胃)功能涉及現(xiàn)代醫(yī)學的消化吸收、能量代謝、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫等多系統(tǒng)的功能。養(yǎng)殖生產(chǎn)中部分動物常因先天稟賦不足、群體排序低下、消化吸收功能障礙、免疫機能低下等處于亞健康狀態(tài),這部分動物約占健康群體的5%～10%,其整體素質(zhì)難以跟上全群平均水平,表現(xiàn)為時常腹瀉,生產(chǎn)性能、機體抗病能力下降,中獸醫(yī)辨證多屬脾虛。中獸醫(yī)脾的防衛(wèi)功能與現(xiàn)代獸醫(yī)學中的免疫系統(tǒng)有相似之處,與黏膜免疫有著某種內(nèi)在聯(lián)系。脾虛多有腸道黏膜免疫系統(tǒng)改變。研究表明,脾虛泄瀉的發(fā)病機制與免疫調(diào)節(jié)有關(guān),而消化系統(tǒng)的免疫作用主要通過小腸的免疫來實現(xiàn)的[1]。本試驗采用利血平復(fù)制大鼠脾虛模型,觀察十二指腸、空腸、回腸組織結(jié)構(gòu)的改變,腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞及杯狀細胞的變化以及 TLR2的表達情況,揭示脾虛大鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)及免疫功能的變化規(guī)律,為中藥調(diào)控脾虛,開發(fā)抗病促壯中藥添加劑奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠12只,體重250 g±20 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 利血平(廣東邦民制藥廠有限公司),免疫組化用 anti-TLR2抗體(bs-1019R,Beijing Biosynthesis Biotechnology Co.,LTD,China),免疫組化 SABC試劑盒(KGSP04 histostain-plus kit,Key Gen Biotech,Nanjing,China),DAB顯色劑(Vector Laboratories);石蠟切片機(Leica RM 2145),顯微鏡(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany),Image-Pro Plus 2.1分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司),Motic圖像分析系統(tǒng)。

1.3 脾虛大鼠模型復(fù)制 試驗大鼠分為對照組和脾虛組,每組6只。試驗前禁食12～16 h,自由飲水。脾虛組每天肌肉注射利血平0.5 mg/kg體重,對照組每天肌肉注射生理鹽水 0.5 mL/只,連續(xù)7 d。觀測大鼠體重的變化及臨床表現(xiàn)。

1.4 取材 造模第8天,剖殺各組試驗大鼠,取十二指腸、空腸、回腸中段,用冷生理鹽水沖洗干凈,立即置于4%甲醛溶液中固定。常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片(3μm),備用。

1.5 指標檢測及方法 (1)絨毛長度及黏膜厚度的測定：H.E.染色、光鏡下觀察比較對照組與脾虛組大鼠腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu),并應(yīng)用Image-Pro Plus 5.1分析系統(tǒng),測量十二指腸、空腸和回腸的絨毛長度、腸黏膜厚度,脾虛組和對照組分別選取十二指腸、空腸和回腸組織切片各6張,每張切片測量5個最長的腸絨毛長度,進行統(tǒng)計,取其平均值。(2)小腸上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞的測定：H.E.染色,顯微鏡下統(tǒng)計100個柱狀上皮細胞內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量,每只大鼠分別統(tǒng)計十二指腸、空腸和回腸各3張切片,求各組各腸段的平均值。(3)腸道TLR2表達量的測定：SABC免疫組織化學方法及Motic病理圖象分析系統(tǒng),顯微鏡下統(tǒng)計腸道橫斷面固有層及絨毛頂端內(nèi)單位面積TLR2(陽性物面積/視場總面積×100%)表達情況并觀察其分布。每組隨機選取3只大鼠,每只大鼠分別統(tǒng)計不同腸段3張切片的腸道橫斷面固有層及絨毛頂端內(nèi)單位面積TLR2表達量,并求取平均值。

1.6 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計 應(yīng)用SPSS 12.0軟件對測定的數(shù)據(jù)進行組間方差分析和顯著性檢驗。試驗結(jié)果采用平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 脾虛模型大鼠臨床表現(xiàn)和體重變化 脾虛組大鼠第3天開始出現(xiàn)精神倦怠,嗜臥,懶動,拱背,扎堆等臨床癥狀;采食量明顯減少,造模第7天,與對照組比較體重顯著下降(P＜0.05,圖1)。以上臨床癥狀及體重變化表明大鼠脾虛模型復(fù)制成功。

2.2 脾虛大鼠小腸組織形態(tài)學變化 光鏡下觀察可見,對照組大鼠十二指腸、空腸、回腸上皮結(jié)構(gòu)完整,層次分明(見中插彩版圖2 A、B、C)。脾虛組大鼠十二指腸、空腸、回腸絨毛腸黏膜頂端上皮細胞變性、壞死、脫落,固有層裸露(見中插彩版圖2 D、E、F)。

2.3 脾虛大鼠小腸絨毛長度和腸黏膜厚度 見表1。

由表1可知,與其形態(tài)學變化相應(yīng),脾虛組十二指腸、空腸和回腸的絨毛長度與腸黏膜厚度均發(fā)生了變化,極顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.4 脾虛大鼠小腸上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量 見表2。

由表2可知,脾虛組十二指腸、空腸和回腸的上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量均極明顯多于對照組(P＜0.01)。

2.5 脾虛大鼠小腸黏膜TLR2表達的變化 見中插彩版圖3和表3。

由圖3和表3可見,TLR2陽性物質(zhì)為棕黃色,主要分布在小腸絨毛頂端與黏膜下層。與對照組比,脾虛組大鼠十二指腸、空腸和回腸的絨毛頂端與黏膜下層TLR2的表達量均顯著下降(P＜0.01或P＜0.05)。

表1 脾虛大鼠小腸絨毛長度和腸黏膜厚度(±SD,n=6) (μm)

表1 脾虛大鼠小腸絨毛長度和腸黏膜厚度(±SD,n=6) (μm)

*：與對照組比較差異顯著(P＜0.05);**：與對照組比較差異極顯著(P＜0.01),下同

不同腸段 組別 絨毛長度 腸黏膜厚度十二指腸 對照組 678.21±41.48 790.76±39.90脾虛組 591.73±24.50** 694.87±42.84**空腸 對照組 573.17±56.14 668.19±10.99脾虛組 312.87±56.52** 530.11±47.28**回腸 對照組 379.91±17.20 479.67±25.91脾虛組 312.24±20.88** 429.79±27.82**

表2 小腸黏膜上皮淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果(±SD,n=6)(個)

表2 小腸黏膜上皮淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果(±SD,n=6)(個)

組別 上皮內(nèi)淋巴細胞十二指腸 空腸 回腸杯狀細胞十二指腸 空腸 回腸對照組 12.1±1.4 23.3±1.3 20.9±1.1 9.1±0.9 11.5±1.1 17.5±1.1脾虛組 18.5±1.2** 34.5±2.8** 26.9±1.2** 13.2±1.0** 17.7±1.3** 23.1±1.5**

表3 對照組和脾虛組大鼠小腸黏膜TLR2表達量統(tǒng)計結(jié)果(±SD,n=3) (%)

表3 對照組和脾虛組大鼠小腸黏膜TLR2表達量統(tǒng)計結(jié)果(±SD,n=3) (%)

組別 絨毛頂端十二指腸 空腸 回腸黏膜下層十二指腸 空腸 回腸對照組 12.4±1.9 9.2±0.8 18.2±2.0 21.1±1.8 4.5±0.4 18.1±1.7脾虛組 6.5±0.8** 4.4±0.9** 8.2±1.1** 4.8±0.8** 3.6±0.2* 10.7±1.2**

3 討論

小腸是消化道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運的主要部位,同時小腸黏膜也是機體防止病原侵襲的第一道防線[2],而脾虛與腸道消化吸收及黏膜免疫功能低下存在密切關(guān)系[3]。小腸黏膜結(jié)構(gòu)的良好狀態(tài)是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收以及發(fā)揮黏膜免疫功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其中小腸的絨毛長度、黏膜厚度及絨毛表面積是衡量小腸消化吸收功能的重要指標[4]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),脾虛大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)受損嚴重,尤以十二指腸和空腸受損最為顯著,表現(xiàn)為黏膜上皮脫落,固有層裸露。與對照組相比,十二指腸、空腸和回腸絨毛長度及黏膜厚度均顯著下降。上述結(jié)果均提示脾虛大鼠小腸消化吸收面積減少、功能減弱,必然導致大鼠生長受阻,這一點從脾虛大鼠體重顯著下降得到佐證。

小腸上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞在腸道發(fā)揮黏膜免疫功能過程中均起到非常重要的作用。小腸上皮內(nèi)淋巴細胞是一類獨特的細胞群,在細胞介導的黏膜免疫和維持上皮的完整性上起重要作用,能抑制腸黏膜超敏反應(yīng),識別上皮細胞是否受細菌、病毒的感染,并分泌細胞因子,以發(fā)揮抗細菌、抗病毒、抗感染和抗局部細胞癌變的作用。杯狀細胞則可以通過在黏膜表面分泌黏液在其局部執(zhí)行特異性或非特異性免疫功能[5]。淋巴細胞和杯狀細胞執(zhí)行免疫功能過強則會造成免疫損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),脾虛大鼠的小腸上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞均顯著高于對照組,提示脾虛大鼠小腸組織結(jié)構(gòu)的損傷很可能是局部免疫反應(yīng)過強而造成的免疫損傷。那么造成免疫損傷的機制何在呢?

近年來研究發(fā)現(xiàn),TLRs的激活及引發(fā)的下游一系列信號分子活化可能是過度免疫反應(yīng)造成腸黏膜屏障功能受損的關(guān)鍵點。TLRs可表達于腸道黏膜上皮細胞、固有層的巨噬細胞、樹突狀細胞、纖維母細胞以及微血管內(nèi)皮細胞上,識別共生菌或病原菌表達的PAMPs,與黏膜耐受和保護有密切的關(guān)系[2,4]。其中TLR2在天然免疫應(yīng)答中的重要性不容忽視,是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[6-7]。TLR2是TLR家族的一個重要成員,其存在對于腸道黏膜具有重要的保護作用[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),脾虛大鼠小腸黏膜 TLR2的表達量顯著下降,提示脾虛大鼠腸道過強免疫反應(yīng)并非由TLR2介導的同時,在一定程度上說明,小腸局部天然免疫功能將受到抑制,這與小腸組織結(jié)構(gòu)損傷情況一致。

綜上所述,小腸黏膜結(jié)構(gòu)的損傷是脾虛引起動物體重下降的原因之一,局部過強的免疫反應(yīng)是造成小腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷的主要機制,且此過程并非通過TLR2介導;同時小腸結(jié)構(gòu)的損傷及TLR2表達的顯著下降均提示其抵御病原侵襲的功能下降。

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