李 俊,丁 鵬,時建立,徐紹建,孫文博,吳家強,王金寶,周 順

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)院,山東濟南250014;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南250100;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島266109)

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)為圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬成員,是一種單股負鏈環(huán)狀的DNA病毒,無囊膜,病毒粒子直徑為17 nm。臨床上對于該病毒相關(guān)疾病的診斷主要根據(jù)其臨床癥狀,但由于豬圓環(huán)病毒同豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒等引起的疾病臨床癥狀相似,臨床癥狀和病理變化只能作為初步診斷的依據(jù),難以確診。熒光定量PCR技術(shù)最早由Higuchi在1992年提出,1996年美國PE公司推出首臺Real-time檢測系統(tǒng),使 Real-time PCR得以真正的應(yīng)用和推廣。它可對樣品中的核酸進行準確的定量檢測,具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點,已成為病原檢測的重要方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株 豬圓環(huán)病毒2型山東分離株SD2(DQ478947),無PCV1污染的PK-15細胞,E.coli DH5α菌種,由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器 熒光定量PCR儀購自BIO-RAD公司,PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、DNA連接試劑盒、PCR試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank已發(fā)表的PCV2分離株的序列,采用Primer5.0軟件,設(shè)計如下兩對特異性引物,擴增豬圓環(huán)病毒2型完整ORF3基因和ORF3基因中196bp片段,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測豬圓環(huán)病毒引物序列

1.4 標準品的制備與定量 PCR產(chǎn)物回收純化,插入pMD-18T載體,按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌,將PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。將上述質(zhì)粒做30倍稀釋后,用紫外分光光度計測定其濃度,計算標準品拷貝數(shù),10倍梯度稀釋,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)條件的確定 按順序加入以下試劑,建立25μL PCR反應(yīng)體系：12.5μL 2×Fast Start Universal SYBRGreen Master、8.5μL Rnase free水、上下游引物 YG1、YG2各1μL(終濃度 300 nmol/L)、2μL模板。按以下程序進行Real-time PCR反應(yīng)：95℃15 min,95℃15 s,58℃1 min,40個循環(huán)。

1.6 擴增產(chǎn)物的溶解曲線分析 熒光定量PCR擴增結(jié)束后,添加 Dissociation stage,95℃15 s,58℃1 min,95℃15 s。在升溫變性時收集熒光信號,經(jīng)軟件分析后獲得擴增產(chǎn)物的Tm值。試驗所用儀器為BIO-RAD多重熒光定量PCR儀,數(shù)據(jù)分析軟件為iQTM5.2.0。

1.7 標準曲線的建立 選擇每微升含有107、106、105、104、103拷貝數(shù)的標準品作為模板,在BIO-RAD多重熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR擴增,得到相應(yīng)的動力學(xué)曲線,自動計算產(chǎn)生標準曲線。

1.8 特異性試驗 以豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)所抽提的DNA或cDNA為模板和雙蒸水進行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測,以確定該方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(同時將倍比稀釋的DNA進行PCR檢測) 以每微升含有 108、107、106、105、104、103、102、101、100標準品為模板,進行普通 PCR 和SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測,確定該方法的敏感性。

1.10 重復(fù)性試驗 用熒光定量PCR儀對3份不同拷貝數(shù)的標準品進行重復(fù)檢測,每個樣品重復(fù)3次,根據(jù)每個稀釋度的標準品的CT值進行變異系數(shù)計算,確定該方法的重復(fù)性

1.11 臨床樣品檢測 采取臨床送檢的25例具有PMWS疑似癥狀豬病料,用常規(guī) PCR和 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 標準品的制備 PCR擴增后取10μL PCR產(chǎn)物,用2%瓊脂糖凝膠電泳,能檢測到約300 bp的特異條帶,陽性重組質(zhì)粒約有3 000 bp與預(yù)期的擴增片段相符(圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒電泳結(jié)果

2.2 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴增后的溶解曲線分析 溶解曲線分析是內(nèi)置于定量熱循環(huán)儀軟件中的分析步驟,通過溶解曲線分析,以驗證PCR產(chǎn)物的特異性。見圖2。

圖2 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR溶解曲線

2.3 標準曲線的建立 選擇每微升含有107、106、105、104、103拷貝數(shù)的標準品作為模板,按照優(yōu)化后的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)條件,制作標準曲線。標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.999,斜率為-3.312,軸截距為 39.12,線性方程為 Y=-3.312 X+39.12,SYBRGreenⅠ熒光定量PCR擴增效率為100.4%。見圖3。

圖3 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR標準曲線

2.4 特異性試驗 提取不同病毒DNA,進行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng),結(jié)果這些病毒的擴增曲線始終為上揚,為水平線,表明該方法有很好的特異性。見圖4。

圖4 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果

2.5 敏感性試驗 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR能檢測的最低濃度為10拷貝/μL,而普通PCR能檢測的最低模板濃度為1×103拷貝/μL。表明該方法檢測豬圓環(huán)病毒2型的敏感性是普通PCR的100倍。見圖4。

2.6 重復(fù)性試驗 用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測不同濃度的樣品,每個濃度3個重復(fù),并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析,結(jié)果見表2。重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于5%,說明該方法具有很好的重復(fù)性(標準差和變異系數(shù)采用Microsoft office Execel表格中的相關(guān)公式計算)。

圖5 SYBR GreenⅠ 熒光定量 PCR敏感性試驗結(jié)果(拷貝/μL)

表2 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

2.7 臨床樣品檢測結(jié)果 見表3。

表3 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測比較

3 討論

研究表明,PCV2僅能導(dǎo)致輕微的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。當該病毒與PRV、PPV、PRRSV或細菌等共同感染時,一定程度上影響了機體對PRRSV和PRV疫苗的免疫應(yīng)答能力[8],則會復(fù)制出典型的PMWS癥狀?？焖?、準確地檢測PCV2有助于做出科學(xué)、正確的診斷。

本試驗設(shè)計兩對特異性引物O1 O2和YG1YG2,分別擴增整個ORF3基因和其中196 bp特異片段。以引物YG1YG2作為熒光定量PCR檢測引物。針對ORF3基因的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的建立,為ORF3基因轉(zhuǎn)錄情況和功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

本試驗分別運用普通PCR方法和SYBR GreenⅠ實時定量PCR方法對臨床送檢病豬組織及血清進行PCV2的檢測。所有常規(guī)PCR檢測陽性的樣品,SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測結(jié)果都是陽性,并將陽性樣品間檢出率提高15個百分點。臨床檢測中,可將反應(yīng)時間優(yōu)化縮短為1.5 h,可更快速地檢測PCV2感染情況。

本試驗建立的SYBR GreenⅠ實時PCR方法特異性強、敏感性高、操作方便,適用于PCV2感染的群體血清流行病學(xué)調(diào)查,為了解國內(nèi)豬群中PCV2流行情況和 PMWS的早期診斷提供技術(shù)支撐。