董 虹,楊 凱,程 飛,余 進(jìn),劉鳳華,許劍琴

(1.北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京昌平102206;2.北京農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京昌平102206;3.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技系,北京昌平102206;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193)

應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體將發(fā)生一系列保護(hù)性反應(yīng),熱休克基因的激活和表達(dá)所產(chǎn)生的熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)作為“分子伴侶”而參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)位及生物合成等過(guò)程,使細(xì)胞和機(jī)體產(chǎn)生熱耐受。高溫刺激后,隨著機(jī)體受熱時(shí)間的延長(zhǎng),各組織細(xì)胞受不同程度的熱作用后均有HSP的合成,其中以Hsp70的合成量最多,其合成量與受熱程度和受熱時(shí)間有關(guān)。隨著Hsp70的增多,細(xì)胞存活率增高,受損減輕,這顯示出 Hsp70對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。Hsp70增加有助于機(jī)體盡可能快地獲得熱適應(yīng),增強(qiáng)熱耐受力[1]。由石膏、蒼術(shù)、黃柏、藿香組成的抗熱應(yīng)激中藥復(fù)方,具有清熱瀉火、解暑和中、燥濕健脾之功效,用于防治動(dòng)物在夏季高溫高濕環(huán)境感受濕熱之邪后出現(xiàn)的濕熱證[2-4]。本文從分子和蛋白水平檢測(cè)了該方對(duì)Hsp70表達(dá)的影響,以期探討該方的抗熱應(yīng)激機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 中藥復(fù)方 藿香(Herba Agastachis)、蒼術(shù)(Rhizoma Atractylodis)、黃柏(Cortex Phelloden-dri)、石膏(Gypsum Fibrosum)按 1∶1∶1∶0.5比例組成,自制合劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠30只,200±20 g,雌雄各半,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)分為對(duì)照組、熱應(yīng)激組和中藥組,每組各10只。對(duì)照組和熱應(yīng)激組大鼠按3.0 mL/只灌服滅菌生理鹽水,中藥組按3.0 mL/只(6.25 g/kg體重)灌服給藥,連續(xù)5 d,第5天,熱應(yīng)激組和中藥組大鼠放于人工氣候倉(cāng)中進(jìn)行熱應(yīng)激處理,熱應(yīng)激條件為41℃,60%濕度,2 h后大鼠脫頸椎處死,分離空腸組織,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后,液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Real-time PCR檢測(cè)Hsp70的表達(dá)

1.3.1 總RNA提取及RT-PCR 按照TRIZOL總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取空腸組織中的RNA,提取完成后,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度,1.2%甲醛變性膠電泳檢測(cè)其完整性。RNA檢測(cè)合格后用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA：取2.0μL Oligo-d T18(10 mmol/L)與 2.0μL d NTPs(10 mmol/L)加入到有2.0μL RNA(1μg/μL)的0.2 mL Eppendof管中,75℃變性 5 min,立即置冰上冷卻。然后每管中加入2.0μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL),8.0μL 5×反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液(10 mmol/L),0.8μL RNA 酶抑制劑(50 U/μL),用滅菌的0.1%DEPC處理水補(bǔ)足總體積至40μL 37℃反應(yīng)2 h,95℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 min,立即使用或-20℃保存。

1.3.2 熒光定量PCR 根據(jù)Genbank提供的序列,引物使用Primer premier 5.0設(shè)計(jì),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,引物參數(shù)見(jiàn)表1。應(yīng)用Stratagene公司的熒光定量PCR試劑,反應(yīng)體系如下：cDNA：1.0 μL,引物1.0 μL,Briliant SYBR Green QPCR master Mix：10 μL,補(bǔ)水至 20 μL,每組3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸40 s,40個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件為：95℃1 min,56℃30 s,95℃30 s。各基因的表達(dá)水平由β-actin進(jìn)行均一化,ΔΔCT法檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)中Hsp70基因在各組表達(dá)的相對(duì)差異。

表1 引物序列

1.4 Hsp70在空腸組織中的蛋白表達(dá) 根據(jù)凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物)從100 mg空腸組織中提取總蛋白,樣品-80℃保存?zhèn)溆?按照Hsp70檢測(cè)試劑盒(美國(guó) RB)說(shuō)明,采用雙抗夾心ELISA法,利用核酸檢測(cè)蛋白儀(美國(guó) BIO-RAD)檢測(cè)大鼠空腸組織總蛋白中 Hsp70蛋白的表達(dá)。用Hsp70蛋白表達(dá)和總蛋白的比值代表Hsp70在空腸組織中的表達(dá)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠臨床癥狀及體溫變化 對(duì)照組大鼠在整個(gè)熱應(yīng)激試驗(yàn)期間,精神狀態(tài)良好,食欲正常及活動(dòng)正常;熱應(yīng)激組大鼠在熱應(yīng)激過(guò)程中表現(xiàn)精神煩躁不安,大量出汗以致渾身濕透,且張口呼吸,飲水增加,食欲減少;中藥組大鼠在熱應(yīng)激過(guò)程中也表現(xiàn)出煩躁不安,飲水增加,頭及全身出汗。應(yīng)激后立即測(cè)大鼠肛溫、體溫均升高,超過(guò)了40℃,和對(duì)照組比較差異均極顯著,說(shuō)明均達(dá)到了高溫刺激的效果。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大鼠熱應(yīng)激后肛溫變化

2.2 空腸組織Hsp70 mRNA的表達(dá)變化 Hsp70的溶解曲線峰值在90℃,β-actin的溶解曲線峰值在86℃,兩個(gè)曲線的溶解溫度均一,峰的形狀也較銳利,見(jiàn)圖1A。其PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后所得產(chǎn)物是目的條帶,見(jiàn)圖2。從圖B可以看出,與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組和中藥組大鼠空腸組織中Hsp70 mRNA的表達(dá)均顯著升高(P＜0.01),且中藥組和熱應(yīng)激組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.3 空腸組織中Hsp70的蛋白表達(dá) 從圖3可以看出,與對(duì)照組相比(7.37±2.12),熱應(yīng)激組(8.65±3.01)和中藥組(11.22±2.04)大鼠空腸組織中Hsp70蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01),且中藥組顯著高于熱應(yīng)激組(P＜0.01)。

3 討論

熱刺激HSP是一組生物體在應(yīng)激情況下由熱休克基因所編碼合成的序列,能對(duì)抗更為嚴(yán)重的應(yīng)激損傷。Hsp70是HSP中最保守和最重要的HSP家族。一般認(rèn)為,Hsp70可以通過(guò)分子伴侶、抗氧化作用、協(xié)同免疫等作用增強(qiáng)熱耐受性[5]。由于Hsp70的多功能性,因此如何通過(guò)藥物作用增強(qiáng)Hsp70 mRNA的轉(zhuǎn)錄已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。陳威巍等[6]研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)顆粒(主要成分為紅參、黃芪、紅景天等)可增強(qiáng)熱適應(yīng)機(jī)體肝與心肌細(xì)胞Hsp70的表達(dá)強(qiáng)度,減輕熱適應(yīng)和應(yīng)激組機(jī)體的熱損傷。馬得瑩等[7]研究顯示,女貞子、五味子和四君子湯都能顯著提高熱應(yīng)激蛋雞肝臟Hsp70基因表達(dá),從而達(dá)到抗熱應(yīng)激的作用,本試驗(yàn)證明,自制中藥復(fù)方不僅能提高 Hsp70 mRNA的表達(dá),也能提高Hsp70的蛋白表達(dá)。

圖1 中藥復(fù)方對(duì)Hsp70 mRNA表達(dá)的影響

環(huán)境高溫高濕所產(chǎn)生的熱應(yīng)激在中醫(yī)理論中屬溫?zé)岚Y,因此用藥上以清輕涼潤(rùn)、甘寒、咸寒為主,分別采用解表、清熱、涼血、滋陰等方法。本試驗(yàn)采用中藥復(fù)方由石膏、蒼術(shù)、黃柏、藿香組成,方中石膏清熱瀉火,解熱鎮(zhèn)痛,利尿利膽,蒼術(shù)燥濕健脾;黃柏清濕熱、瀉火毒,有利膽、利尿、擴(kuò)張血管等作用;藿香芳香化濕[8]。四藥合用具有清熱瀉火、解暑和中、燥濕健脾功效的功效。前期試驗(yàn)研究已證明,本中藥復(fù)方能緩解高溫導(dǎo)致的豬和雞的熱應(yīng)激反應(yīng)[2-4]。本研究結(jié)果表明,中藥復(fù)方抗熱應(yīng)激的原理,可能是誘導(dǎo)體內(nèi)Hsp70的蛋白和基因的高表達(dá),Hsp70再啟動(dòng)一系列反應(yīng)而達(dá)到抗熱應(yīng)激的作用。

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