趙 朝，席新龍，袁祖貽，劉 艷，程曼麗，紀(jì)玉強(qiáng)，楊小波 (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一

附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710061;2西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者，E-mail:zuyiyuan@mail.xjtu.edu.cn)

急性冠脈綜合征(ACS)是嚴(yán)重危害冠心病患者健康的重大問(wèn)題，包括不穩(wěn)定性心絞痛(unstable angina，UA)和急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，通常是由于易損斑塊的纖維帽破潰，血栓形成，管腔堵塞引起，免疫細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞在其中發(fā)揮著重要的作用［1，2］。既往研究顯示斑塊的穩(wěn)定性和T細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)，T細(xì)胞少經(jīng)常與穩(wěn)定性斑塊伴隨，易損斑塊內(nèi)含較多的T細(xì)胞［3］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)輔助性T細(xì)胞(Th)亞群1(Th1)的反應(yīng)或阻斷其效應(yīng)分子可以減輕動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)使斑塊的穩(wěn)定性增加，提示T淋巴細(xì)胞與急性冠脈綜合征的關(guān)系密切［4］。本研究擬通過(guò)對(duì)ACS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Th1/Th2的分析，進(jìn)一步探討Th細(xì)胞在ACS中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2009－04～2009－10在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院的患者92例，按WHO冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為急性心肌梗死(AMI)組、不穩(wěn)定性心絞痛(UA)組和穩(wěn)定性心絞痛(SA)組。AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)為缺血性胸痛和肌酸激酶同工酶(CK-MB)或肌鈣蛋白I(TnI)升高2倍以上;UA組為入院前48 h內(nèi)出現(xiàn)過(guò)靜息性胸痛，有一過(guò)性的ST段水平或下斜性壓低和/或T波倒置，無(wú)CK-MB或TnI升高2倍以上，冠狀動(dòng)脈造影至少有1支血管直徑狹窄＞50%;SA為符合加拿大心血管協(xié)會(huì)SAⅡ級(jí)或Ⅲ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，冠狀動(dòng)脈造影顯示至少有1支血管直徑狹窄＞50%。對(duì)照組為年齡和性別匹配的同期住院的冠狀動(dòng)脈造影所有的血管直徑狹窄＜50%及臨床癥狀排除冠脈痙攣的住院患者。

排除標(biāo)準(zhǔn):6個(gè)月以內(nèi)的心肌梗死、缺血性胸痛到抽血時(shí)間超過(guò)24 h、心房顫動(dòng)、心瓣膜病、急性炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病、肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病及服用免疫抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 佛波酯(PMA)和離子霉素(ionomycin)購(gòu)自Calbiochem公司;多甲藻葉綠素蛋白(Percp)標(biāo)記的 CD4抗體、異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的IFN-γ抗體、異藻青蛋白(APC)標(biāo)記的IL-4抗體、同型對(duì)照為FITC標(biāo)記的IgG1和APC標(biāo)記的IgG1、莫能霉素(monensin)和FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司，總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;DNA熒光染料(SYBR GreenⅡ)購(gòu)自TaKaRa公司，引物由TaKaRa公司合成。

1.2.2 常規(guī)檢查 血脂、心肌酶和肌鈣蛋白均為入院常規(guī)檢查。

1.2.3 人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 所有觀察對(duì)象均于住院次日清晨空腹抽取靜脈血5 ml，肝素抗凝。用人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。PBS液洗2次，分為2份，一份用3 ml RPMI1640培養(yǎng)液重懸，用于流式細(xì)胞分析;一份用于實(shí)時(shí)定量PCR。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) Th1/Th2細(xì)胞頻率 PBMC 培養(yǎng)液中加入 PMA(50 μg/L)、ionomycin(500 μg/L)和 monensin(0.67 ml/L)，37 ℃，5%CO2孵箱中孵育4 h，收集PBMC，PBS液洗1遍，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2 ×106/ml。加入 20 μl CD4-PerCP 抗體，4 ℃孵育30 min。PBS液洗1次，加入250 μl固定/破膜液(美國(guó)BD公司)，4℃孵育20 min。用1 ml破膜/洗液洗滌2次，重懸后平均分為檢測(cè)管和對(duì)照管，按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)管依次加入IFN-γ-FITC和IL-4-APC抗體，對(duì)照管加入各自的同型對(duì)照抗體，室溫避光孵育30 min，破膜/洗液洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用前向散射光(FSC)及側(cè)向散射光(SSC)圈出淋巴細(xì)胞，以CD4+細(xì)胞設(shè)門(mén)，每一樣品檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PMBC的IFN-γ、T-bet、STAT4、IL-4和 GATA3的 mRNA 表達(dá) ①總RNA的提取:1 ml Trizol試劑裂解細(xì)胞，提取總RNA。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):應(yīng)用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在溫度梯度PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，合成的cDNA于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。③引物的設(shè)計(jì)與合成:擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。④實(shí)時(shí)熒光定量PCR:配置20 μl反應(yīng)體系在IQ5熒光定量PCR儀上擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件為95℃ 10 s預(yù)變性;95℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共 40 個(gè)循環(huán)，2－△△CT計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平差異。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列Tab 1 Primers used in real-time PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 CK、CK-MB、TnI用中位數(shù)和極差表示，其余數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。CK、CK-MB、TnI和 mRNA水平不符合正態(tài)分布，用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，病人一般資料和細(xì)胞頻率符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料組間差異的比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 各組患者年齡、性別、高血壓、吸煙、糖尿病和血脂的比較均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，AMI組較UA、SA組和對(duì)照組的CK、CK-MB、TnI顯著升高(P＜0.01，見(jiàn)表2)。

表2 各組患者一般資料的比較Tab 2 Clinical characteristics of patients and normal controls

2.2 各組Th1和Th2細(xì)胞頻率的比較 UA和AMI組患者Th1(IFN-γ/CD4+T)細(xì)胞頻率較SA組和對(duì)照組顯著升高(P＜0.01，見(jiàn)圖1)。各組間Th2(IL-4/CD4+T)細(xì)胞頻率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，見(jiàn)表3)。

圖1 各組Th1/Th2細(xì)胞頻率的比較Fig 1 Comparison of Th1/Th2 cell frequencies among 4 groups

表3 各組Th1/Th2細(xì)胞頻率的比較 (%)Tab 3 Comparison of frequencies of Th1/Th2 cell among four groups(%)

2.3 各組Th1和Th2相關(guān)基因mRNA水平的比較UA和AMI組患者Th1相關(guān)基因IFN-γ、T-bet和STAT4的mRNA水平較SA組和對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)。各組間 Th2細(xì)胞相關(guān)基因 GATA3和IL-4的mRNA變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，見(jiàn)表4)。

表4 各組Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)基因mRNA水平的比較Tab 4 Comparison of mRNA expression of Th1/Th2 related gene expression among four groups

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞對(duì)AS斑塊的形成和不穩(wěn)定斑塊的破潰均起重要的作用［5，6］。有研究表明易損斑塊內(nèi)T細(xì)胞較多，穩(wěn)定性斑塊內(nèi)的T細(xì)胞較少。T細(xì)胞根據(jù)其在免疫應(yīng)答中的功能不同分為輔助性T細(xì)胞(Th)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr)，動(dòng)物研究中表明它們均參與了AS不穩(wěn)定斑塊的形成［7，8］。為了進(jìn)一步明確輔助性T細(xì)胞亞群在急性冠脈綜合征中的可能作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血循環(huán)中Th1/Th2細(xì)胞，結(jié)果顯示ACS患者中Th1細(xì)胞的頻率較SA患者和對(duì)照顯著增高，而各組患者Th2細(xì)胞頻率無(wú)明顯變化，提示ACS患者存在Th1/Th2細(xì)胞功能失衡。

Th按分泌細(xì)胞因子的不同至少分為T(mén)h1和Th2兩群。Th1細(xì)胞主要分泌 IFN-γ，T-bet和STAT4是Th1細(xì)胞分化和IFN-γ分泌的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子;Th2細(xì)胞主要分泌IL-4，GATA3是Th2細(xì)胞分化必需的核轉(zhuǎn)錄因子。已有研究證實(shí)阻斷IFN-γ或T－bet不僅可以減輕AS斑塊的進(jìn)展，而且使斑塊內(nèi)膠原合成增加，使斑塊更趨于穩(wěn)定［9，10］。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)4組患者PBMC的Th1和Th2細(xì)胞相關(guān)因子IFN-γ、T-bet和STAT4、IL-4和GATA3的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞相關(guān)因子IFN-γ、T-bet和STAT4的mRNA水平在ACS患者中明顯升高，而Th2細(xì)胞相關(guān)因子IL-4和GATA3的mRNA水平在各組之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步證實(shí)了ACS中存在Th1細(xì)胞的過(guò)度激活。盡管Th1細(xì)胞過(guò)度激活促發(fā)ACS的機(jī)制尚不明確，但可能與Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、減少膠原合成以及促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，使纖維帽變薄有關(guān)［1］。臨床研究表明，血清IFN-γ濃度升高的患者，心梗、中風(fēng)和死亡率更高［11］，進(jìn)一步提示，Th1細(xì)胞的活化可能與 ACS發(fā)生密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中Th1細(xì)胞的頻率和相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平在SA和對(duì)照組患者并無(wú)明顯的差異，與以往的研究結(jié)果有出入［12］，可能的原因是以往研究的對(duì)照組選自健康查體者，而本研究的對(duì)照組是經(jīng)冠脈造影檢查排除冠心病，但在冠心病危險(xiǎn)因素如年齡、性別、高血壓、吸煙、糖尿病、血脂異常等方面與冠心病組匹配，而這些因素本身可能增強(qiáng)了Th1亞群的反應(yīng)。但是，與SA患者和對(duì)照相比，ACS患者Th1亞群細(xì)胞比例和相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平仍顯著增高，提示ACS對(duì)Th1亞群的影響遠(yuǎn)超出年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病及血脂異常等因素的影響，使Th1細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)。

因此，盡管我們尚不能確定Th1/Th2細(xì)胞功能失衡是不穩(wěn)定斑塊破潰的使動(dòng)因素，但Th1/Th2細(xì)胞失衡加劇了機(jī)體的全身以及斑塊局部炎癥反應(yīng)，這可能會(huì)使纖維帽變薄變?nèi)?，?dǎo)致斑塊破潰，促進(jìn)急性冠脈綜合征的發(fā)生。

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