高 博，徐 微，趙新淮

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

兩種蛋白水解物的FENTON反應(yīng)修飾與抗氧化活性變化

高 博，徐 微，趙新淮*

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

利用堿性蛋白酶分別水解大豆分離蛋白、酪蛋白，對(duì)兩種水解物進(jìn)行Fenton反應(yīng)修飾。用紫外吸收及Lowry法評(píng)價(jià)修飾反應(yīng)對(duì)兩種水解物的影響，結(jié)果表明，修飾后產(chǎn)物與原水解物顯著不同，表明修飾反應(yīng)對(duì)水解物組成產(chǎn)生影響?？寡趸钚苑治霭l(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白水解物的修飾產(chǎn)物的IC50從2.92mg/mL降低至1.36～2.28mg/mL，酪蛋白水解物的修飾產(chǎn)物的IC50從2.80mg/mL降低至0.89～2.12mg/mL，表明Fenton反應(yīng)可提高修飾產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力。

大豆分離蛋白，酪蛋白，水解物，F(xiàn)enton反應(yīng)，抗氧化活性

蛋白質(zhì)是重要的食品成分，具有不可替代的作用。通過蛋白酶水解蛋白質(zhì)來制備具有各種生物活性的水解物（如抗癌肽、抗病毒肽、抗菌肽、抗氧化肽等），是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外對(duì)抗氧化肽的研究工作大多集中在酶水解、分離純化及氨基酸組成分析上。雖然我們對(duì)蛋白質(zhì)水解物的抗氧化機(jī)制還不完全清楚，但是已有的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)水解物的抗氧化活性與其氨基酸組成有關(guān)；氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，肽段中幾乎都含有酪氨酸殘基［1-3］。氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的氧化修飾是蛋白質(zhì)修飾作用的結(jié)果之一［4］。利用氧自由基氧化，可以導(dǎo)致芳香族氨基酸側(cè)鏈的羥基化［5］。Fenton試劑產(chǎn)生的·OH是最活潑的氧自由基［6］。苯丙氨酸殘基被·OH羥基化可以產(chǎn)生三個(gè)產(chǎn)物，分別為對(duì)-、間-、鄰-酪氨酸［7］。因此，蛋白質(zhì)水解物中苯丙氨酸被·OH修飾，將可能改善水解物的抗氧化活性。為此，利用堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG）分別水解大豆分離蛋白和酪蛋白，通過Fenton試劑（H2O2+FeSO4系統(tǒng)）產(chǎn)生·OH來修飾這兩種蛋白水解物；利用紫外法及Lowry法確認(rèn)修飾產(chǎn)物中發(fā)生的羥基化作用；最后，評(píng)價(jià)兩種蛋白水解物修飾產(chǎn)物的清除DPPH自由基活性，確認(rèn)Fenton反應(yīng)對(duì)兩種蛋白水解物抗氧化活性的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大豆蛋白粉 哈爾濱高科技蛋白有限公司；酪蛋白 上海山浦化工有限公司；堿性蛋白酶

Alcalase 2.4L FG，Novo公司，酶活 2.4AU/g，密度1.18g/mL；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） Sigma公司；其他所有試劑 均為分析純。

UV-2401PC型紫外可見分光光度計(jì) 島津公司；AL204型分析天平、DELTA 320型精密pH計(jì)

梅特勒-托利多儀器中國(guó)有限公司；Kjeltec TM2300型自動(dòng)凱氏定氮儀 瑞士Foss公司；LGJ-1型空冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；H -1型微型漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；YH -4BS型遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備 按照文獻(xiàn)［8］中的方法進(jìn)行。取250g脫脂大豆粉，加入10倍（W/V）的蒸餾水，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.5。攪拌浸提2h，4000r/min離心 20min，棄去不溶性物質(zhì)。2mol/L HCl調(diào)上清液的pH至4.5，靜置1～2h，棄去上清液，下層蛋白質(zhì)凝乳4000r/min離心20min，棄去上清液。沉淀物加入1.5～2倍（W/V）蒸餾水，攪拌、離心，棄去上清液；重復(fù)2次。沉淀物中加入1倍（W/V）蒸餾水，1mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，冷凍干燥即得大豆分離蛋白。分析結(jié)果表明，其蛋白質(zhì)含量約為96%（干重）。

1.2.2 大豆分離蛋白和酪蛋白的水解物制備 根據(jù)文獻(xiàn)［9-12］中的方法進(jìn)行。用蒸餾水配制濃度為5%（W/W）的大豆分離蛋白或酪蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，酶添加量為1g蛋白質(zhì)0.3AU，在50℃恒溫水浴中進(jìn)行酶解。酶解作用2h后，調(diào)節(jié)水解液的pH至4.5。100℃加熱10min使酶滅活，5000r/min離心20min，分離出上清液。測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量和游離氨基含量，計(jì)算水解度。水解液冷凍干燥，固體保存于-20℃冰箱中備用。

1.2.3 水解物的Fenton反應(yīng)修飾 采用雙因素實(shí)驗(yàn)，研究反應(yīng)時(shí)間（選擇0.5、1、2、3h）、蛋白水解物中苯丙氨酸殘基摩爾數(shù)與Fenton試劑（FeSO4-EDTA溶液與等濃度的H2O2溶液混合）摩爾數(shù)的比例（以Phe∶H2O2比例表示，選擇1∶0.5、1∶1和1∶2）對(duì)修飾產(chǎn)物的影響。固定水解物濃度為1%（W/W），反應(yīng)體系為pH 3.5的磷酸鹽緩沖體系。

1.2.4 Fenton反應(yīng)對(duì)兩種蛋白水解物的影響

1.2.4.1 對(duì)水解物紫外吸收的影響 取稀釋適當(dāng)倍數(shù)的樣品溶液，倒入1cm石英比色皿中，于280nm處測(cè)定吸光度［13］。用蒸餾水或各修飾反應(yīng)使用試劑（與樣品溶液稀釋倍數(shù)）調(diào)零點(diǎn)，平行測(cè)定三次。

1.2.4.2 對(duì)水解物L(fēng)owry法評(píng)價(jià)的影響 1mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的樣品溶液中加入5mL試劑甲，混勻后37℃水浴中10min；加入0.5mL試劑乙，混勻后37℃水浴中30min，測(cè)定750nm的吸光度［14］。以蒸餾水進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定三次。

試劑甲：將10g Na2CO3、2g NaOH和0.5g酒石酸鉀鈉溶于500mL蒸餾水；將0.5g CuSO4·5H2O溶于100mL蒸餾水，使用前將兩溶液以50∶1混合。試劑乙：將福林酚試劑用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑，稀釋至最終酸濃度為1mol/L。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

1.3.1.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用凱氏定氮法［15］。

1.3.1.2 游離氨基含量與蛋白質(zhì)水解度（DH）測(cè)定采用茚三酮法［16］。

大豆分離蛋白水解度計(jì)算公式如下：

式中：5.71-大豆蛋白質(zhì)的換算系數(shù)；N1-大豆蛋白水解物的氮含量，mg/mL；0.35mmol/g-大豆分離蛋白的游離氨基含量（測(cè)定所得結(jié)果）；7.8mmol/g-大豆蛋白的肽鍵含量。

酪蛋白水解度計(jì)算公式如下：

式中：6.38-酪蛋白的換算系數(shù)；N1-酪蛋白水解物的氮含量，mg/mL；0.44mmol/g-酪蛋白的游離氨基含量（測(cè)定所得結(jié)果）；8.2mmol/g-酪蛋白的肽鍵含量。

1.3.2 抗氧化活性分析 無水乙醇溶解DPPH，使DPPH最終濃度為20μmol/L。取2mL DPPH乙醇溶液與4mL已稀釋適當(dāng)倍數(shù)的樣品溶液混合，室溫下避光反應(yīng)30min，測(cè)定其在517nm處的吸光度，同時(shí)用無水乙醇進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定三次［17-18］。以DPPH自由基的清除率和樣品濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求IC50值。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A517空白-空白樣在 517nm處的吸光度；A517樣品-樣品在517nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Excel（2003）軟件進(jìn)行可重復(fù)雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

兩種蛋白經(jīng)堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG）水解后，測(cè)得大豆分離蛋白、酪蛋白水解物的DH分別為9%、10%，其清除 DPPH自由基的 IC50值分別為

2.1 Fenton反應(yīng)對(duì)兩種蛋白水解物的修飾

2.1.1 對(duì)兩種蛋白水解物的紫外吸收的影響 采用分光光度法評(píng)價(jià)Fenton反應(yīng)對(duì)兩種蛋白水解物的紫外影響，結(jié)果如表1、表2。

從數(shù)據(jù)結(jié)果中可以看出，隨Phe∶H2O2比例的增加（即反應(yīng)體系中Fenton試劑添加量的增加），兩種蛋白水解物的修飾產(chǎn)物在280nm處的吸光度均呈明顯增加的趨勢(shì)，且隨反應(yīng)時(shí)間的變化不顯著。由于修飾反應(yīng)中羥自由基進(jìn)攻肽鏈中的苯環(huán)，使苯丙氨酸殘基轉(zhuǎn)化為酪氨酸殘基和進(jìn)一步羥基化的衍生物；羥基是給電子基，當(dāng)它與苯環(huán)的共軛體系相連時(shí)，導(dǎo)致大π鍵電子云流動(dòng)性增大，分子中電子的躍遷的能級(jí)差減少，最大吸收向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，顏色加深，所以修飾產(chǎn)物在280nm處的吸光度會(huì)明顯增加。此外，由于羥自由基反應(yīng)速度極快［19］，在短時(shí)間內(nèi)（例如0.5h）已完全反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)修飾產(chǎn)物在280nm處的吸光度就無明顯變化。

表1 Fenton反應(yīng)修飾對(duì)大豆蛋白水解物的紫外吸收影響

表2 Fenton反應(yīng)修飾對(duì)酪蛋白水解物的紫外吸收影響

2.1.2 Fenton反應(yīng)對(duì)水解物L(fēng)owry法測(cè)定的影響

采用Lowry法評(píng)價(jià)Fenton反應(yīng)對(duì)兩種蛋白水解物的影響作用，見表3、表4。

表3 Fenton反應(yīng)修飾對(duì)大豆蛋白水解物的Lowry法評(píng)價(jià)的影響

隨Fenton試劑添加量的增加，Lowry法測(cè)得蛋白質(zhì)水解物修飾產(chǎn)物的吸光度增大，說明Fenton反應(yīng)修飾使兩種修飾產(chǎn)物中存在的酪氨酸殘基數(shù)量增加，且增加幅度隨Fenton試劑添加量的增加而增加。同樣，在Fenton試劑添加量不變時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)Lowry法測(cè)得的吸光度無明顯變化，原因同前。

表4 Fenton反應(yīng)修飾對(duì)酪蛋白水解物的Lowry法評(píng)價(jià)的影響

兩種蛋白質(zhì)水解物的紫外分光光度分析、Lowry法分析結(jié)果表明，F(xiàn)enton反應(yīng)確實(shí)對(duì)水解物的組成產(chǎn)生了影響，在肽鏈中引入了新的羥基。

2.2 Fenton反應(yīng)對(duì)修飾產(chǎn)物的抗氧化活性的影響

對(duì)蛋白水解物、Fenton反應(yīng)修飾產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行分析，選用常用的DPPH自由基清除活性評(píng)價(jià)方法，見表5、表6。

表5 Fenton反應(yīng)修飾的大豆分離蛋白水解物的DPPH自由基清除活性

表6 Fenton反應(yīng)修飾的酪蛋白水解物的DPPH自由基清除活性

表7 Phe∶H2O2比例和反應(yīng)時(shí)間對(duì)Fenton反應(yīng)修飾的影響的顯著性

從分析結(jié)果中看出，F(xiàn)enton反應(yīng)修飾有效地提高了兩種蛋白質(zhì)水解物的抗氧化活性。大豆分離蛋白水解物的修飾產(chǎn)物的IC50為1.36～2.28mg/mL，小于大豆分離蛋白水解物的IC50；同樣，酪蛋白水解物的修飾產(chǎn)物的IC50為0.89～2.12mg/mL，也小于酪蛋白水解物的IC50。這些結(jié)果表明修飾反應(yīng)改善了兩個(gè)蛋白質(zhì)水解物對(duì)DPPH自由基的清除活性。同時(shí)，F(xiàn)enton試劑添加量增加，修飾產(chǎn)物的IC50降低更多，表明其抗氧化活性改善幅度增加，這與肽鏈中羥基的引入水平有關(guān)；但在Fenton試劑添加量相同時(shí)，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)修飾產(chǎn)物的IC50沒有明顯變化，原因還是同前所述。

2.3 Phe∶H2O2比例和反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白水解物Fenton反應(yīng)修飾的顯著性分析

采用Excel軟件，對(duì)Phe：H2O2比例、反應(yīng)時(shí)間兩個(gè)因素進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

分析結(jié)果看出，Phe∶H2O2比例對(duì)修飾產(chǎn)物的紫外吸收、Lowry法評(píng)價(jià)和DPPH自由基清除活性的影響極顯著（P＜0.01），而反應(yīng)時(shí)間影響不顯著。這表明，F(xiàn)enton試劑的添加量是影響兩種蛋白質(zhì)水解物性質(zhì)的主要因素，即兩種蛋白質(zhì)水解物的抗氧化活性可以通過Fenton試劑的添加量而調(diào)控。

3 結(jié)論

3.1 利用堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG）分別對(duì)大豆分離蛋白、酪蛋白進(jìn)行水解，制備出DH分別為9%、10%的兩個(gè)水解產(chǎn)物，其清除DPPH自由基的IC50值分別為2.92、2.80mg/mL。

3.2 利用Fenton反應(yīng)修飾兩種蛋白質(zhì)水解物后，發(fā)現(xiàn)Fenton反應(yīng)導(dǎo)致修飾產(chǎn)物在280nm處的吸光度明顯增大，Lowry法評(píng)價(jià)修飾產(chǎn)物也表明其在750nm處的吸光度增大，說明Fenton反應(yīng)修飾對(duì)兩種蛋白水解物的組成產(chǎn)生影響。

3.3 對(duì)DPPH自由基清除活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，兩種蛋白質(zhì)水解物修飾產(chǎn)物的IC50從2.92mg/mL或2.80mg/mL降低至1.36～2.28mg/mL或0.89～2.12mg/mL，表明修飾反應(yīng)可以改善蛋白質(zhì)水解物的DPPH自由基清除活性。

3.4 方差分析結(jié)果表明，Phe∶H2O2比例對(duì)修飾產(chǎn)物的性質(zhì)（包括DPPH自由基清除活性）的影響極顯著（P＜0.01），反應(yīng)時(shí)間的影響不顯著（P＞0.05），表明Fenton試劑添加量是影響兩種蛋白水解物DPPH自由基清除活性的主要因素。

［1］Elias RJ，Bridgewater JD，Vachet RW，et al.Antioxidant mechanisms of enzymatic hydrolysates of beta-lactoglobulin in food lipid dispersions［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（25）：9565-9572.

［2］Hernandez-Ledesma B，Amigo L，Recio I.ACE-Inhibitory and radical-scavenging activity of peptides derived from betalactoglobulin f（19-25）.Interactions with ascorbic acid［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（9）：3392-3397.

［3］嚴(yán)群芳.大豆抗氧化肽的分離及生物活性的研究［D］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

［4］Park D，Xiong YL.Oxidative modification of amino acids in porcine myofibrillar protein isolates exposed to three oxidizing systems［J］.Food Chemistry，2007，103（2）：607-616.

［5］Amici A，Levine RL，Tsai L，et al.Conversion of amino acid residue in proteins and amino acid homopolymers to carbonyl derivatives by metal-catalyzed oxidation reaction［J］.The Journal of Biological Chemistry，1989，264（6）：3341-3346.

［6］楊芬，張瑞萍，賀玖明，等.羥自由基的產(chǎn)生、捕集及檢測(cè)方法［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（7）：692-697.

［7］Roberto B，Xia Y，Ruggero R，et al.Detection of hydroxyl radicals by D-phenylalanine hydroxylation：a specific assay for hydroxyl radical generation in biological systems［J］.Analytical Biochemistry，2001，290（1）：138-145.

［8］Wang XS，Tang CH，Li BS，et al.Effects of high-pressure treatment on some physicochemical and functional properties of soy protein isolates［J］.Food Hydrocolloids，2008，22（4）：560-567.

［9］Cumby N，Zhong Y，Naczk M，et al.Antioxidant activity and water-holding capacity of canola protein hydrolysates［J］.Food Chemistry，2008，109（1）：144-148.

［10］Kexue Z，Zhou HM，Qian HF.Antioxidant and free radicalscavenging activities of wheat germ protein hydrolysates（WGPH）prepared with alcalase［J］.Process Biochemistry，2006，41（6）：1296-1302.

［11］ Meng XJ，ZhangXZ，WangXY.Preparation and Antioxidative Effects of Soybean Peptides［J］.Chemical Research in Chinese Universities，1999，15（2）：140-145.

［12］Mao XY，Ni JR，Sun WL，et al.Value-added utilization of yak milk casein for the production of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides［J］.Food Chemistry，2007，103（4）：1282-1287.

［13］曹紅翠.紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量［J］.廣東化工，2007，34（8）：93-94.

［14］LowryOH，RosebroughNJ，F(xiàn)arrAL，etal.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.Journal of Biochemistry，1951，193（1）：265-275.

［15］中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.5-2003［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［16］趙新淮，馮志彪.蛋白質(zhì)水解物水解度的測(cè)定［J］.食品科學(xué)，1994，15（11）：65-67.

［17］Shimada K，F(xiàn)ujikawa K，Yahara K，et al.Antioxidative properties of xanthan on the antioxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40（6）：945-948.

［18］Vilailak K，Soottawat B，Duangporn K，et al.Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type［J］.Food Chemistry，2007，102（4）：1317-1327.

［19］孫存普，張建中，段紹瑾.自由基生物學(xué)導(dǎo)論［M］.合肥：中國(guó)科技大學(xué)出版社，1999.

Modification of two protein hydrolysates by Fenton reaction and change of their antioxidant activity

GAO Bo，XU Wei，ZHAO Xin-huai*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Soy protein isolate hydrolysates or casein hydrolysates were prepared by hydrolysis of soy protein isolate or casein with alcalase 2.4L FG respectively，and then modified by Fenton reaction.Ultraviolet absorption and Lowry assay were applied to estimate the effects of Fenton reaction on the two hydrolysates.The results indicated that the modified hydrolysates were different from the original ones and showed the impacts of Fenton reaction on the compositions of two protein hydrolysates.The antioxidant activities of the modified protein hydrolysates were analyzed for DPPH radical scavenging activity.The analysis results showed that the lC50values of the modified soy protein isolate hydrolysates or casein hydrolysates on DPPH radical were decreased from 2.92 or 2.80mg/mL to 1. 36～2.28 or 0.89～2.12mg/mL，which clearly indicated that modification of two protein hydrolysates by Fenton reaction improved their free radical scavenging activities.

soy protein isolate；casein；hydrolysates；Fenton reaction；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2010）09-0104-04

2009-10-22 *通訊聯(lián)系人

高博（1984-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（863）（2006AA10Z324）。