張 敏，余群力，張 麗

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

甘肅肅南牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌的分離鑒定

張 敏，余群力*，張 麗

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

以5份甘肅肅南牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品為原料進(jìn)行乳酸菌的分離和鑒定，共分離出25株乳酸菌。對其中23株產(chǎn)乳酸的菌株利用形態(tài)、生理生化分析和碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。經(jīng)鑒定得出23株分屬為4個屬，11個種。其中乳桿菌屬［Lactobacillus（L.）］11株，乳球菌屬（Lactococcus）6株，明串珠菌屬（Leuconostoc）3株，腸球菌屬（Enterococcus）3株。具體來說，L.plantarum 6株、L.fermentum 2株、L.brevis 1株、L.minor 2株、L.lactis subsp.lactis 3株、L.lactis subsp.cermoris 3株、L.mesenteroides 1株、L.lactis 2株、E.faecium 1株、E.faecalis 1株、E.durans 1株。L.plantarum占分離菌株的26.1%，是優(yōu)勢菌株。

傳統(tǒng)發(fā)酵乳，乳酸菌，分離，鑒定

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是能利用葡萄糖（或可利用的碳水化合物）發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的一群細(xì)菌。乳酸菌只是一種習(xí)慣叫法，并不是微生物分類學(xué)上的名稱［1］。用乳酸菌發(fā)酵食品不產(chǎn)生任何毒素或毒性物質(zhì)，產(chǎn)生的乳酸及一些特殊的芳香物質(zhì)既增加了營養(yǎng)價值又賦予了特殊的風(fēng)味，因此一直被我國人民所喜愛，全國各地均有不同形式的乳酸菌發(fā)酵食品在市場銷售或民間流傳［2-4］。甘肅肅南地區(qū)具有非常特殊的地理生態(tài)環(huán)境，它地處河西走廊中部的祁連山北麓，平均海拔高度2700m左右，屬高寒地區(qū)，自然生態(tài)資源好，草原肥沃，污染少，具有豐富的牦牛奶資源，是甘肅省重要的畜牧業(yè)商品基地。當(dāng)?shù)鼐用癫捎们О倌陙硌匾u古老而傳統(tǒng)的方法制作發(fā)酵乳，生產(chǎn)方法比較簡單。在大多情況下，居民經(jīng)常采用存放發(fā)酵奶和鮮奶的相同容器來進(jìn)行持續(xù)發(fā)酵，這也導(dǎo)致了當(dāng)?shù)亓餍械陌l(fā)酵產(chǎn)品逐漸演變。這些產(chǎn)品不僅風(fēng)味獨(dú)特、組織細(xì)膩、口感純正，而且在當(dāng)?shù)刈匀粶囟认麓娣泡^長時間還能保證其口感和狀態(tài)，同時還保存了自然環(huán)境中的乳酸菌。本實(shí)驗(yàn)對甘肅肅南牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳進(jìn)行乳酸菌的分離、鑒定，旨在發(fā)現(xiàn)肅南地區(qū)所含乳酸菌類群，以期豐富我國的乳酸菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵乳 樣品采自甘肅肅南牧區(qū)5份牧民家庭自制的發(fā)酵乳，編號分別為H、I、J、K、M，以無菌操作采集后放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆?；植物乳桿菌（ L.plantarum）、嗜 熱 鏈 球 菌（Streptococcusthermophilus）IFO13957 購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心；MRS培養(yǎng)基、Elliker培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、吲哚實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、H2S實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)等培養(yǎng)基以及其他的生化實(shí)驗(yàn)試劑 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［1］、《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》［5］、《乳酸細(xì)菌—基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用》［6］配制；實(shí)驗(yàn)所用的試劑 均為分析純和生化試劑。

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1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離 從各個樣品中分別取1mL接種于脫脂乳培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)24h進(jìn)行增菌。分別取0.2mL增菌液于滅菌后的兩個培養(yǎng)皿中，其中一個傾入10～15mL的MRS培養(yǎng)，另一個傾入Elliker培養(yǎng)基，搖勻，于37℃倒置培養(yǎng)48h。選取在MRS培養(yǎng)基上有透明圈的及在Elliker培養(yǎng)基上呈乳白色的單個菌落再進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察 以肉眼觀察菌落形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。

1.2.3 革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn) 取24h培養(yǎng)的乳酸菌疑似菌落制成水涂片，經(jīng)革蘭氏染色后，在10×100倍顯微鏡下觀察，記錄樣本的顏色和形狀。同時，做過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。將G+的桿菌或球菌，過氧化氫酶陰性的菌株暫定為乳酸菌的疑似菌落。

1.2.4 乳酸菌的純化 用接種環(huán)挑取經(jīng)顯微觀察認(rèn)定為乳酸菌的疑似菌落，繼續(xù)劃線于MRS培養(yǎng)基上，重復(fù)操作，不斷純化直至得到單菌落，再經(jīng)過鏡鑒確認(rèn)為純菌株后轉(zhuǎn)接于MRS瓊脂斜面上，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 產(chǎn)乳酸實(shí)驗(yàn) 采用紙層析法進(jìn)行產(chǎn)乳酸實(shí)驗(yàn)。棄去不產(chǎn)乳酸的菌株。參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。

1.2.6 乳酸菌的鑒定 接觸酶實(shí)驗(yàn)、碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、溫度實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)等，參照文獻(xiàn)［1，5-6］進(jìn)行。根據(jù)培養(yǎng)物的反應(yīng)特性檢索《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》，判定其生物學(xué)別［7］。

2 結(jié)果與討論

從甘肅肅南地區(qū)牧民家庭中采集的5份傳統(tǒng)發(fā)酵乳，經(jīng)分離純化并結(jié)合革蘭氏染色、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)以及產(chǎn)乳酸實(shí)驗(yàn)，共分離出23株乳酸菌，其中桿菌11株，球菌12株。乳酸桿菌多為中央凸起、邊緣整齊、不透明狀菌落，大小約1～3mm之間，細(xì)胞形態(tài)有粗桿、長桿、細(xì)長狀桿、短桿，多數(shù)呈鏈條狀排列。乳酸球菌多是邊緣整齊，大約0.5～3mm，乳白或者灰白色，圓形隆起，有光澤，電子顯微鏡下多為球形、卵球形。從培養(yǎng)物中共分離出23株具有上述特征的菌株，將其認(rèn)定為乳酸菌疑似菌株。

2.1 乳酸桿菌屬、種的鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)以植物乳桿菌（L.plantarum）作為參考菌株，把所分離到的11株無芽孢革蘭氏染色陽性、不還原硝酸鹽、不產(chǎn)硫化氫、不運(yùn)動、接觸酶陰性的桿菌鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

H1、H4、J2、K1、K5和M5除符合乳桿菌屬的特征外，能發(fā)酵果糖、甘露醇、山梨醇、纖維二糖、松三糖、蜜二糖、木糖、棉籽糖、海藻糖、七葉靈等，能夠在15℃和45℃條件下生長，查《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》鑒定其為植物乳桿菌（L.plantarum）。

H3和I2能夠發(fā)酵阿拉伯糖、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、蜜二糖、棉籽糖、海藻糖和木糖等，不能發(fā)酵七葉靈、松三糖和甘露醇等，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》鑒定其為發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）。

J4能夠發(fā)酵阿拉伯糖、七葉靈、乳糖、蜜二糖、棉籽糖、木糖等，不能發(fā)酵纖維二糖、甘露醇、松三糖、山梨醇以及海藻糖，鑒定為短乳桿菌（L.brevis）。

K2和M4能夠發(fā)酵纖維二糖、七葉靈、果糖、麥芽糖、松三糖、海藻糖等，不能發(fā)酵阿拉伯糖、乳糖、蜜二糖、棉籽糖和木糖等，其生物學(xué)特性和微小乳桿菌相近，將K2、M4鑒定為微小乳桿菌（L.minor）。

2.2 乳酸球菌屬、種的鑒定結(jié)果

2.2.1 乳酸球菌屬的鑒定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)以嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）IFO13957作為參考菌株。由表2可知，菌株H2、I3、J5、I1等9株球菌觸酶實(shí)驗(yàn)陰性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。菌株H5、J3、M3過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生大量氣體，在6.5%NaCl、pH9.6、45℃下均不能生長，鑒定為明串珠菌屬的菌株。在同型發(fā)酵乳酸球菌中，菌株H2、I3、J1、J5、K3和M2在10℃條件下能生長、45℃不生長、能夠生長于0.1%美藍(lán)牛乳，不能生長于6.5%NaCl和pH9.6條件下，其生物學(xué)特性與乳球菌屬相近，因此鑒定為乳球菌屬（Lactococcus）的菌株。菌株 I1、M1、K4在10℃、45℃、6.5%NaCl和pH9.6下都生長，能生長于0.1%美藍(lán)牛乳，將它們鑒定為腸球菌屬內(nèi)的菌株。所以，這12株球菌分別歸屬于乳球菌屬（6株）、腸球菌屬（3株）、明串珠菌（3株）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.2 乳酸球菌各屬中內(nèi)種的鑒定結(jié)果

2.2.2.1 乳球菌屬內(nèi)種的鑒定結(jié)果 菌株H2、J1和K3能發(fā)酵乳糖、麥芽糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵棉籽糖、蜜二糖和松三糖，無運(yùn)動性。其特性符合乳酸乳球菌乳酸亞種的生物學(xué)特性，鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactis subsp.lactis）。

菌株I3、J5和M2能夠發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵麥芽糖、蜜二糖、松三糖以及棉籽糖，符合乳酸乳球菌乳脂亞種的生物學(xué)特性，定為乳酸乳球菌乳脂亞種（L.lactis subsp.cremoris）。

表1 乳桿菌屬、種的鑒定結(jié)果

表2 乳酸球菌屬、種的鑒定結(jié)果

2.2.2.2 明串珠屬內(nèi)種的鑒定結(jié)果 菌株H5可利用蔗糖產(chǎn)生葡聚糖，能發(fā)酵乳糖、蜜二糖和棉籽糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵阿拉伯糖和麥芽糖，符合腸膜明串珠菌葡聚糖亞種的生物學(xué)特性，暫定為腸膜明串珠菌葡聚糖亞種（L.mesenteroides subsp.dextranicum）。

菌株J3和M3可利用蜜二糖和蔗糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵阿拉伯糖。符合乳明串珠菌的生物學(xué)特性，暫定為乳明串珠菌（L.lactis）。

2.2.2.3 腸球菌屬內(nèi)種的鑒定結(jié)果 菌株I1能發(fā)酵松三糖、山梨醇、蔗糖和乳糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵阿拉伯糖和棉籽糖，無運(yùn)動性。符合糞腸球菌的生物學(xué)特性，鑒定為糞腸球菌（E.faecalis）。

菌株M1能發(fā)酵蜜二糖、蔗糖和阿拉伯糖產(chǎn)酸，不能發(fā)酵棉籽糖、松三糖和山梨醇，無運(yùn)動性。符合屎腸球菌的生物學(xué)特性，鑒定為屎腸球菌（E.faecium）。

菌株K4能發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵阿拉伯糖、松三糖、棉籽糖、山梨醇、蔗糖和蜜二糖產(chǎn)酸，無運(yùn)動性。符合堅強(qiáng)腸球菌的生物學(xué)特性，鑒定為堅強(qiáng)腸球菌（E.durans）。

3 結(jié)論

從5份甘肅肅南地區(qū)牧民家庭自制的發(fā)酵乳中共分離出23株乳酸菌，經(jīng)鑒定得出23株分屬為4個屬，11個種。其中 L.plantarum 6株、L.fermentum 2株、L.brevis 1株、L.minor 2株、L.lactis subsp.lactis 3株、L.lactis subsp.cermoris 3株、L.mesenteroides 1株、L.lactis 2株、E.faecium 1株、E.faecalis 1株、E.durans 1株。乳桿菌屬和乳球菌屬均是優(yōu)勢菌屬，且L.plantarum占分離菌株的26.1%，是優(yōu)勢菌株。

［1］凌代文.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

［2］張文羿.青海省海西地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵山羊乳中乳酸菌得分離及鑒定［J］.中國乳品工業(yè)，2006，34（11）：4-8.

［3］國立東.傳統(tǒng)乳制品種乳酸菌得分離及性能研究［J］.食品科學(xué)，2006，27（3）：60-64.

［4］趙勝娟，趙暄，羅紅霞.新疆傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的分離鑒定［J］.中國乳品工業(yè)，2007，35（11）：8-11.

［5］東秀珠.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［6］張剛.乳酸細(xì)菌—基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

［7］D H Bergey，P H A Sneath，John G Holt.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology［M］.Williams&Wilkins，1986（2）：1047 -1245.

Isolation and identification of lactic acid bacteria from traditional fermented milk in Sunan prefecture of Gansu province

ZHANG Min，YU Qun-li*，ZHANG Li

（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

25 strains of lactic acid bacteria were isolated from traditional fermented milk gathering from the herdsmen’s homes in Sunan prefecture of Gansu province.23 strains which produced Lactate were carried out morphological，physiological and biochemistry analysis and carbohydrate fermentation test.The results showed that the 23 strains belonged to 4 categories and 11 species，which were 11 strains of Lactobacillus（L.），6 strains of Lactococcus，3 strains of Leuconostoc and 3 strains of Enterococcus.Specifically，there were L.plantarum（6 strains），L.fermentum（2 strains），L.brevis（1 strain），L.mino（r2 strains），L.lactis subsp.lactis（3 strains），L.lactis subsp.cermoris（3 strains），L.mesenteroides（1 strain），L.lactis（2 strains），E.faecium（1strain），E.faecalis（1strain），E.durans（1strains）.The results obtained showed that L.plantarum was the predominant strain accounted for 26.1% of total isolation.

traditional fermented milk；lactic acid bacteria（LAB）；isolation；identification

TS252.1

A

1002-0306（2010）11-0196-04

2009-11-18 *通訊聯(lián)系人

張敏（1984-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

甘肅省蘭州市科技項目（2008-1-41）。