孫仁山，隋建峰，李 鳳，唐書謙，吳先林，楊 濤，趙莉蓉，伍津津，李文維，雷 霞，冉新澤，鄭曉莉，楊桂紅，周金鈴

(第三軍醫(yī)大學(xué):1.大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所皮膚科，重慶 400042;2.基礎(chǔ)部醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中心 400038;3.預(yù)防醫(yī)學(xué)院復(fù)合傷研究所，重慶 400038)

大部分慢性蕁麻疹患者找不到明確的過敏原及病因。部分患者血清存在組胺釋放活性，這種組胺釋放活性是由自身抗體所致，大部分為抗高親和力 Ig E受體(FcεR1)自身抗體，少部分為抗Ig E或其他抗體[1-9]。自身血清皮膚試驗(yàn)(autologous serum skin test，ASST)、嗜堿粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)和嗜堿粒細(xì)胞活化試驗(yàn)(Basophilactivation test，BAT)可以對上述的自身抗體進(jìn)行檢測。嗜堿粒細(xì)胞活化后，CD63分子表達(dá)增強(qiáng)，并從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面，很多文獻(xiàn)以CD63分子的表達(dá)為BAT檢測指標(biāo)，但CD63除在肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞表達(dá)外，在血小板及單核細(xì)胞等均可表達(dá)[10]。CD203c分子特異性地表達(dá)在肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞表面，本研究探討以CD203c分子為BAT的觀察指標(biāo)，判斷慢性蕁麻疹外周血清對嗜堿粒細(xì)胞的活化情況，并以求判斷慢性蕁麻疹的自身免疫性質(zhì)。

1 資料與方法

1.1 病例與分組 按文獻(xiàn)[11-12]選擇本科室(2010年1月至2010年6月)來就診的慢性蕁麻疹患者，隨機(jī)選取ASST陽性患者血清26例(A組)、ASST陰性患者血清24例(B組)和健康對照血清20例(C組)。

1.2 試劑與儀器 抗人 CD203cPE、CRTH 2-FITC及CD3Per-CP為美國eBioscience公司產(chǎn)品，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純，流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，激光共聚焦顯微鏡為德國LEICA公司產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡為日本Nikon產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本處理及嗜堿粒細(xì)胞懸液制備 從1個健康自愿者肘靜脈采血30 m L，肝素抗凝備用。每批標(biāo)本均設(shè)陰性和陽性對照，在陽性對照管中加入經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)1∶10稀釋的0.4 mmol FMLP 100μL，陰性對照管中以PBS 100μL替代FM LP，在檢測管中加入100μL待檢測血清，各管中加入肝素抗凝全血100μL，37℃水浴15 min，隨后用含依地酸(EDTA，0.02 mol/L)的PBS 2 m L終止反應(yīng)，離心棄上清液，加入CRTH 2-FITC/CD203c-PE/CD3Per-CP預(yù)混合的單克隆抗體15μL，置室溫10 min后用溶血素處理10 min，以溶解紅細(xì)胞，繼用含0.1%牛人血清蛋白的PBS 2 m L洗滌2次，加PBS 700 μL重懸待用。

1.3.2 檢測分析 每次檢測前均用Flow Check熒光微球Beckman Coulter校準(zhǔn)儀器，標(biāo)本上機(jī)后，先以前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)參數(shù)大致觀察細(xì)胞形態(tài)。然后在CD3和SSC雙參數(shù)點(diǎn)圖上選取排除了CD3陽性的有核細(xì)胞，排除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。在CD203c和C RTH-2雙參數(shù)點(diǎn)圖上選取有核細(xì)胞中CD 203c陽性的細(xì)胞。將純的嗜堿粒細(xì)胞用CD203c參數(shù)圖進(jìn)行分析，以未激活陰性為對照，觀察CD203c抗原表達(dá)上調(diào)比例和幅度。以CD 203c表達(dá)上調(diào)細(xì)胞數(shù)的比例達(dá)到10%作為嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。染色細(xì)胞樣品在流式細(xì)胞儀上用Cellquest軟件進(jìn)行檢測，經(jīng)Cellquest或Win MDI2.8軟件分析，獲取直方圖，以平均免疫熒光強(qiáng)度(MFI)表示表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用S PSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，采用方差分析和 Anova檢驗(yàn)。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果 見表1。

表1 慢性蕁麻疹患者血細(xì)胞CD203c表達(dá)結(jié)果()

表1 慢性蕁麻疹患者血細(xì)胞CD203c表達(dá)結(jié)果()

*:P＜0.01，與 B、C 組比較。

組別 n CD203c表達(dá)百分率(%) C D203c表達(dá)強(qiáng)度(MFI)A 組 26 91.24±6.22* 58.2±12.55*B組 24 3.33±1.24 3.70±1.32 C組 20 3.05±1.07 3.20±1.29

3 討 論

慢性特發(fā)性蕁麻疹患者血清中能發(fā)現(xiàn)功能性抗FcεRI或抗Ig E自身抗體，這些患者HLA-DR等位基因頻次增多，這種現(xiàn)象是自身免疫性疾病的特征。有研究表明，在具有自身抗體的慢性蕁麻疹組，有充分的證據(jù)證明它們具有致病性，自身抗體的血漿水平與疾病活動性有密切的聯(lián)系;清除自身抗體可以緩解癥狀。對該抗體進(jìn)行部分純化，可以在Ig G1和IgG 3的成分中發(fā)現(xiàn)抗體。另外一個自身免疫現(xiàn)象也出現(xiàn)在該組中，包括出現(xiàn)抗甲狀腺抗體、呈斑點(diǎn)圖案的抗核抗體等，但沒有發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡[1，13]。定義自身免疫性疾病的標(biāo)準(zhǔn)除上述情況外，還要求在實(shí)驗(yàn)動物身上能夠復(fù)制疾病，盡管目前還沒有用抗FcεRI自身抗體來進(jìn)行動物試驗(yàn)，但檢測出慢性蕁麻疹外周血中的自身抗體，可以避免過多的過敏原檢測費(fèi)用，并為醫(yī)師使用免疫調(diào)節(jié)劑治療該類疾病提供依據(jù)。

抗FcεRI自身抗體主要有自身血清皮膚試驗(yàn)、嗜堿粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)、免疫印跡方法和基于重組蛋白sFcεRIα的ELISA試驗(yàn)等檢測方法。本課題組應(yīng)用這幾種檢測方法并對其進(jìn)行了系統(tǒng)比較研究，認(rèn)為免疫印跡方法穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠;嗜堿粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)可以檢測出功能性的抗FcεRI自身抗體，但操作步驟繁瑣;ASS T方法雖較簡單，但無菌要求嚴(yán)格，測試前需要患者停用抗組胺藥物[11，14-15]。通過比較發(fā)現(xiàn)，3種方法可相互借鑒和彌補(bǔ)，供臨床診斷自身免疫性蕁麻疹時使用。

嗜堿粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)要求純化嗜堿粒細(xì)胞，BAT使用全血標(biāo)本，通過流式細(xì)胞儀測定表面分子的變化判斷靶細(xì)胞的活化，因此試驗(yàn)周期短。由于嗜堿粒細(xì)胞活化后，針對CD63分子變化檢測的信號敏感性強(qiáng)，大多數(shù)文獻(xiàn)采用CD63分子判斷嗜堿粒細(xì)胞的活化，在本研究中使用了特異性強(qiáng)的CD203c分子，通過3次設(shè)門，排除淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等，檢測蕁麻疹血清對嗜堿粒細(xì)胞的活化信號。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，使用的3種抗體標(biāo)記白細(xì)胞，3次設(shè)門可以有效判斷嗜堿粒細(xì)胞的活化情況。本實(shí)驗(yàn)中有2例ASS T陽性血清呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，可能為凝血因子導(dǎo)致的ASST陽性反應(yīng)，而非抗FcεRI抗體所致。由于熒光標(biāo)記抗體的價格因素可能會限制該方法的臨床推廣應(yīng)用。

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