黃鶯，劉珊，楊鵬，王超，杜韞，孫志偉，俞煒源

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所 蛋白質(zhì)工程研究室，北京 100071

2 中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院病理科，北京 100088

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

日本腦炎病毒C蛋白對其復(fù)制子載體自主復(fù)制活性的影響

黃鶯1*，劉珊2*，楊鵬1，王超1，杜韞1，孫志偉1，俞煒源1

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所 蛋白質(zhì)工程研究室，北京 100071

2 中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院病理科，北京 100088

為了研制具有高效自主復(fù)制能力的日本腦炎病毒 (JEV) 復(fù)制子載體，驗證其作為新型復(fù)制子疫苗載體的可能性。以保留全長核心蛋白C基因的JEV復(fù)制子載體pCTCJEV為基礎(chǔ)，通過PCR的方法減短C蛋白的部分基因序列，分別保留 C23和 C68位氨基酸，以Lac Z基因作為報告基因，構(gòu)建了 C基因長短不同的 JEV復(fù)制子載體pCMW-2M-1LACZ、pCMW-2M-3LACZ。將復(fù)制子載體轉(zhuǎn)染表達(dá)JEV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系CME-4，通過Lac Z的表達(dá)檢測JEV復(fù)制子載體表達(dá)外源蛋白的能力，反映了JEV的系列復(fù)制子載體的自主復(fù)制能力。結(jié)果保留C基因全長，C68、C23的復(fù)制子載體表達(dá)外源蛋白的能力相當(dāng)，以上結(jié)果說明僅僅保留C蛋白的69個核苷酸即可保留JEV復(fù)制子載體的自主復(fù)制能力，為進(jìn)一步優(yōu)化JEV復(fù)制子載體，將該載體開發(fā)研制成為高效表達(dá)外源蛋白的疫苗載體提供了依據(jù)。

JEV，C蛋白，復(fù)制子載體

Abstract:To optimize a self-replicate Japanese enciphalitis virus (JEV) replicon, and to make it as an efficient vector to express the heterologous protein, we constructed three JEV replicons by PCR-based shortening the length of capsid genes. The vectors remained full or part of C gene, based on the JEV replicon pCTCJEV.Lac Zwas selected as the reporter gene to verify the self-replicate ability of these DNA-based replicons. While transfected into the cell lines CME-4, which continuously expressing the JEV structure proteins C-prM-E, the JEV replicons pCMW-2M-1LACZ, pCMW-2M-3LACZ, which remained the first 23aa and 68aa of C protein, can express the reporter protein as the same level as pCMW-2M-LACZ with the full-length C protein.These results illustrated that the JEV replicon vector with 69-nt of the C gene can retain the self-replicate ability, and provide valuable tools to construct a possible vector for a long-lasting JEV RNA virus expression system.

Keywords:Japanese enciphalitis virus (JEV), C protein, replicon vector

黃病毒屬病毒成員屬于 (+) RNA病毒，其基因 組的顯著特性是具有自主復(fù)制能力和感染性，裸RNA進(jìn)入敏感細(xì)胞后，能夠大量自主復(fù)制，并且進(jìn)一步翻譯成相應(yīng)的病毒蛋白，在胞內(nèi)包裝成為完整的病毒顆粒[1]。黃熱病毒復(fù)制子通常指將基因組上的結(jié)構(gòu)基因部分切割下來，而保留完整的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，這樣的亞基因組RNA也保留了自主復(fù)制能力，其不但能夠表達(dá)自身非結(jié)構(gòu)蛋白，而且能夠表達(dá)保留的部分結(jié)構(gòu)蛋白和/或添加的外源蛋白。理論上講，這種亞基因組的復(fù)制能力等同于完整的基因組，在復(fù)制過程中，正鏈RNA呈指數(shù)級增加。如果在這種復(fù)制子中插入外源基因，隨著復(fù)制子RNA在細(xì)胞胞漿內(nèi)大量擴(kuò)增，就使得外源基因得到有效表達(dá)，因此，復(fù)制子可作為表達(dá)外源基因的良好載體[2-4]。

本研究即在以往構(gòu)建的 JEV復(fù)制子載體pCTCJEV基礎(chǔ)上[5]，對其進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。pCTCJEV是刪除JEV基因組的結(jié)構(gòu)基因prM和E基因，而保留JEV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域C基因全長的復(fù)制子載體，經(jīng)證實該載體有自主復(fù)制能力，并且能夠有效表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白以及外源蛋白。在此基礎(chǔ)上，我們通過PCR的方法減短C基因的長度，分別保留C23和C68位氨基酸，構(gòu)建了pCMW-2M-1LAC、pCMW-2M-3LAC。將復(fù)制子載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)JEV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系CME-4[6]，通過Lac Z報告基因，檢測復(fù)制子載體的表達(dá)外源蛋白的能力，反映了JEV復(fù)制子載體的自主復(fù)制能力。結(jié)果顯示保留C68、C23的復(fù)制子載體和保留全長C基因的復(fù)制子載體表達(dá)外源蛋白的能力相當(dāng)，說明僅僅保留C基因的69個核苷酸即可保留JEV復(fù)制子載體的自主復(fù)制能力，為我們進(jìn)一步優(yōu)化JEV復(fù)制子載體，將該載體開發(fā)研制成為高效表達(dá)外源蛋白的疫苗載體提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ和Prime star聚合酶等均購自大連寶生物工程有限公司。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體試劑盒、β-Gal staining kit購自Invitrogen公司。pMW118質(zhì)粒購自 Nippon Gene。pcDNA3.1、pBR-JTF、pCTCJEV、pCMV-Lac為本室保存或構(gòu)建。

1.2 復(fù)制子載體pCTCJEV的優(yōu)化

以低拷貝pMW118質(zhì)粒載體為基礎(chǔ)進(jìn)行改造，首先設(shè)計兩條含有SalI-SacI-BamH I-MluI-KpnIXbaI-EcoR I多克隆位點 (MCS) 的寡核苷酸序列D118和P118，用于構(gòu)建一個銜接頭，通過SalI/EcoR I酶切位點克隆到質(zhì)粒載體pMW118中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMW-118L。以質(zhì)粒 pcDNA3.1為模板，用引物pPCMV和引物pSCMV通過PCR擴(kuò)增出長為607 bp的CMV序列。通過SphI/SalI酶切位點克隆到質(zhì)粒載體pMW-118L中，構(gòu)建質(zhì)粒pCMW-118L。以 pCTCJEV為模板，用引物 pT1L/dXFMDV通過PCR擴(kuò)增出長557 bp的片段。以pCTCJEV為模板，用引物pX2MUN/dxMUN通過PCR擴(kuò)增出長約1 515 bp的片段。BsaI酶切兩PCR產(chǎn)物，連接后將連接產(chǎn)物片段純化，以該連接物為模板，引物pT1L/dxMUN擴(kuò)增約2 054 bp片段。通過SalI/MfeI酶切后亞克隆到 pBR-JTF中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBR-2M，進(jìn)一步通過SalⅠ/XbaⅠ雙酶切將pBR-2M的復(fù)制子片段連接到質(zhì)粒載體 pCMW-118L中，構(gòu)建以原載體為基礎(chǔ)的優(yōu)化載體 pCMW-2M (上述所用引物序列見表1)。

表 1 構(gòu)建優(yōu)化復(fù)制子載體 pCMW-2M 以及其衍生載體所需引物Table 1 Primers for optimization of the JEV replicon vectors

1.3 含報告基因Lac Z的復(fù)制子載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pCMV-Lac為模板，用引物 plac/dlac，通過PCR擴(kuò)增Lac Z報告基因序列，利用XhoⅠ和BsrGⅠ酶切位點將報告基因Lac Z插入JEV復(fù)制子pCMW-2M中，得到重組質(zhì)粒pCMW-2M-LAC。

1.4 以C基因長度不等為區(qū)別，進(jìn)行復(fù)制子載體的構(gòu)建

以pCMW-2M-LAC為基礎(chǔ)，利用PCR方法減短 JEV C基因，通過 pTR1/dTR1、pTR1/dTR3引物組合，以pCMW-2M-Lac為模板，分別擴(kuò)增出190 bp、328 bp片段，通過SalI/XhoI酶切位點亞克隆到質(zhì)粒pCMW-2M-LAC中，構(gòu)建以C基因長短不同為區(qū)別的系列表達(dá)LacZ的復(fù)制子載體pCMW-2M-1LAC、CMW-2M-3LAC。

1.5 復(fù)制子載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BHK-21、CME-4以及放大培養(yǎng)

將3種pCMW-2M-LAC載體用XbaI線性化，純化后用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染六孔板中的 BHK-21細(xì)胞，以及表達(dá)JEV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系CME-4，轉(zhuǎn)染CME-4后第4天后收集培養(yǎng)上清，取1/10體積的上清液體分別進(jìn)一步感染細(xì)胞系 CME-4及正常BHK-21細(xì)胞，吸附1～4 h后，更換加5% FCS的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，感染的同時將原細(xì)胞固定原位染色，檢測LacZ的表達(dá)情況，以同樣的方法感染CME-4細(xì)胞系培養(yǎng)假病毒顆粒，進(jìn)一步放大培養(yǎng)2～4代，每一代細(xì)胞均進(jìn)行Lac Z的表達(dá)檢測。

1.6 原位染色檢測Lac Z的表達(dá)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者假病毒顆粒PIPs感染細(xì)胞后第4天，收集上清，PBS沖洗細(xì)胞2～3次，常溫下，細(xì)胞用19∶1的甲醇：醋酸固定液進(jìn)行固定10 min，PBS 沖洗細(xì)胞 2次。按照β-Gal staining kit(Invitrogen) 說明書配制染色溶劑，六孔板每孔加染色液2.5 mL，37℃孵育0.5～2 h，光鏡下觀察細(xì)胞藍(lán)染情況，計算細(xì)胞藍(lán)染率，70%甘油封閉染色后的細(xì)胞各孔，4℃下可以長期保存。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)制子載體的優(yōu)化

pMW-118是一個低拷貝載體，低于10個拷貝/細(xì)菌，研究發(fā)現(xiàn)[7]該載體插入長片段的外源基因，在細(xì)菌中依舊比較穩(wěn)定。為了JEV復(fù)制子載體更方便地插入外源基因，首先我們對原載體pMW-118進(jìn)行改造，將一個銜接頭插入到載體中，引入的這段序列包含一個多克隆位點 (MCS)，改造的質(zhì)粒命名為pMW-118L。同時為了構(gòu)建DNA/RNA based 雙啟動子的復(fù)制子載體，以質(zhì)粒pcDNA3.1為模板，PCR擴(kuò)增出真核啟動子CMV序列。通過SphI/SalI酶切位點克隆到質(zhì)粒載體 pMW-118L中，構(gòu)建質(zhì)粒pCMW-118L，重組質(zhì)粒測序結(jié)果和實驗預(yù)期設(shè)計一致。進(jìn)一步利用PCR的方法對原復(fù)制子載體進(jìn)行優(yōu)化改造 (圖 1)，在原復(fù)制子載體 pCTCJEV的 C-E基因的銜接處，添加XhoI/BsrG I酶切位點，以方便外源基因的插入，同時在外源基因的插入點 3′端位置加入FMDV 2A序列，以保證外源蛋白的正確切割，最終構(gòu)建優(yōu)化后的復(fù)制子載體 pCMW-2M，以下含報告基因的復(fù)制子載體以及不同長度C基因的復(fù)制子載體均以此為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建。

圖1 含報告基因Lac Z的系列復(fù)制子載體的構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of the three JEV replicons including the reporter geneLac Z.

2.2 含報告基因Lac Z的系列復(fù)制子載體的構(gòu)建

Lac Z報告基因長3 057 bp，通過PCR的方式從pCMV-Lac質(zhì)粒中獲得，利用XhoⅠ/BsrGⅠ酶切位點插入 JEV復(fù)制子 pCMW-2M 中，得到重組質(zhì)粒pCMW-2M-LAC。進(jìn)一步利用PCR方法減短JEV C基因，構(gòu)建以 C基因長短不同為區(qū)別的系列表達(dá)Lac Z的復(fù)制子載體pCMW-2M-1LAC，pCMW-2M-3LAC (圖1)，C蛋白分別保留23、68位氨基酸，經(jīng)過酶切鑒定酶切圖譜正確，測序結(jié)果和實驗設(shè)計一致。

2.3 復(fù)制子載體 pCMW-2M-LAC轉(zhuǎn)染 BHK-21細(xì)胞

將復(fù)制子載體 pCMW-2M-LAC線性化后轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，同時設(shè)立一孔未作轉(zhuǎn)染的正常BHK-21細(xì)胞作為陰性對照。轉(zhuǎn)染4 d后X-Gal原位染色檢測β-半乳糖苷酶活性。從圖2中可以看出，復(fù)制子載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后有Lac Z的表達(dá)，但是陽性細(xì)胞較少，表達(dá)量不均一。重復(fù)實驗顯示同樣的結(jié)果，增加轉(zhuǎn)染的DNA量或者采用電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染復(fù)制子載體，陽性細(xì)胞率會有所提高，但是最高不會超過10%。

2.4 復(fù)制子載體 pCMW-2M-LAC轉(zhuǎn)染細(xì)胞系CME-4、CME-17

細(xì)胞系CME-4、CME-17是能穩(wěn)定表達(dá)JEV結(jié)構(gòu)蛋白C-prM-E的細(xì)胞系[6]，將復(fù)制子載體pCMW-2M-LAC轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系CME-4以及CME-17后，Lac Z的陽性率和表達(dá)量都有了明顯提高，如圖3所示，在12孔板中1.6 μg的pCMW-2M-LAC線形化質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染結(jié)構(gòu)蛋白細(xì)胞系CME-4后，有20%左右的細(xì)胞表達(dá)LacZ，部分細(xì)胞藍(lán)染明顯，提示表達(dá)量非常高。一方面證實了JEV復(fù)制子載體具有良好的復(fù)制能力，同時證實了表達(dá)JEV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系具有包裝JEV復(fù)制子載體形成假病毒顆粒的能力。由于Lac Z基因約3.1 kb，構(gòu)建的包裝細(xì)胞系可以將其包裝成為重組的假病毒顆粒，這也提示將來利用復(fù)制子載體系統(tǒng)生產(chǎn)假病毒顆粒疫苗PIPs時，復(fù)制子載體可以承載的外源基因的長度至少可以達(dá)到3 kb。

圖2 X-Gal原位染色法檢測復(fù)制子載體中Lac Z基因在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of theLac Zgene in JEV replicon vector pCMW-2M-LAC by X-GAL in-situ staining. (A) Expression of theLac Zgene of pCMW-2M-LAC in BHK-21 cells. (B) Repeated assay of A. (C) negative BHK-21 cells.

圖3 X-Gal原位染色法檢測LacZ在細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.3 Expression of theLac Zgene by JEV replicon vector pCMW-2M-LAC in cell lines CME-4 and CME-17. Expression of theLac Zgene at Day 4 after transfecting replicon pCMW-2M-LAC into the cell lines CME-4(A) and CME-17(B).

2.5 復(fù)制子載體 pCMW-2M-1LAC、CMW-2M-3LAC轉(zhuǎn)染CME-4以及假病毒顆粒的放大培養(yǎng)

將3種pCMW-2M-LAC復(fù)制子載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系CME-4后，4 d后檢測Lac Z的表達(dá)情況。并且為檢測JEV假病毒顆粒的存在，將原代培養(yǎng)上清繼續(xù)感染細(xì)胞系，培養(yǎng) 4 d后，檢測被感染的下一代細(xì)胞系中Lac Z的表達(dá)，再進(jìn)一步將含假病毒顆粒的上清感染下一代，由圖4可以看出第二代細(xì)胞系中約有 50%左右的細(xì)胞表達(dá) Lac Z，陽性率較 1代有大幅度地增加，從染色情況看表達(dá)量與第一代相當(dāng)。而用第一代的培養(yǎng)上清感染正常的 BHK-21細(xì)胞，陽性率沒有進(jìn)一步增加，表達(dá)量也相對較弱。收獲第二代的細(xì)胞培養(yǎng)上清繼續(xù)感染細(xì)胞系CME-4，陽性細(xì)胞率與第二代相似，大部分細(xì)胞均藍(lán)染。繼續(xù)第3次感染后，陽性細(xì)胞率下降較明顯，表達(dá)量和第一代細(xì)胞、第二代細(xì)胞的檢測結(jié)果相比較有所下降，在進(jìn)一步的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)假病毒顆粒能夠傳代2～3次。根據(jù)第一代感染結(jié)果，計算假病毒顆粒的滴度為1.2×103U/mL，第二代感染結(jié)果計算得到的假病毒顆粒滴度約為1×104U/mL，并且3種復(fù)制子載體表達(dá)Lac Z的能力相當(dāng)。

圖4 X-Gal原位染色法檢測假病毒顆粒的放大培養(yǎng)Fig.4 Expression of theLac Zgene after infecting the JEV PIPs into the cell lines CME-4 for 4 passages. (A, C, E, G, I)The left panel detected the JEV PIPs produced by transfecting pCMW-2M-1LAC into the cell lines CME-4. (B, D, F, H, J) The right panel detected the JEV PIPs produced by transfecting pCMW-2M-3LAC into the cell lines CME-4. Expression of theLac Zgene at Day 4 after infecting CME-4 with the JEV PIPs at passage 1 (A, B); infecting the BHK-21 cells with the JEV PIPs at passage 1 (C, D); infecting CME-4 with the JEV PIPs at passage 2 (E, F); infecting CME-4 with the JEV PIPs at passage 3 (G, H); infecting CME-4 with the JEV PIPs at passage 4 (I, J).

3 討論

以黃病毒基因組為基礎(chǔ)，開發(fā)研制病毒載體是目前黃熱病度屬病毒相關(guān)研究中的一個熱點，因為黃病毒屬的病毒宿主細(xì)胞廣泛，在多種宿主細(xì)胞中感染、復(fù)制，相對簡單的基因組結(jié)構(gòu)及復(fù)制過程使得病毒可在較短時間內(nèi)多次復(fù)制傳代，產(chǎn)生高滴度的病毒。研制能夠表達(dá)外源基因的黃熱病毒載體有3種形式：一是嵌合型活病毒載體，原病毒的結(jié)構(gòu)基因部分被同類病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因代替，構(gòu)建嵌合活病毒。目前主要用于構(gòu)建嵌合型的重組減毒活疫苗，最為成功的是以黃熱病毒減毒活疫苗 YF-17D為基礎(chǔ)而建立的ChimeriVax技術(shù)，以YF-17D為基礎(chǔ)與日本腦炎病毒減毒活疫苗SA14-14-2、WNV、DEN等病毒的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行嵌合，構(gòu)建了新型疫苗 ChimeriVax-JE、ChimeriVax-WN、ChimeriVax-DEN[8-10]，其中 ChimeriVax-JE、ChimeriVax-WN 已經(jīng)進(jìn)入了Ⅲ期臨床試驗。

二是保留原病毒完整的基因組，選擇合適的插入位點，將外源基因插入到病毒基因組中，構(gòu)建重組病毒，通過常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，可以將改構(gòu)的重組活病毒進(jìn)行放大培養(yǎng)。因為這種重組病毒的構(gòu)建破壞了原病毒基因組的完整性，能否得到正確包裝的活病毒受到外源基因的大小，插入位點的選擇等多重因素的影響，目前僅見到少數(shù)關(guān)于該類重組病毒的報道[11-12]。

三是復(fù)制子病毒載體，去除病毒的結(jié)構(gòu)基因部分，插入外源抗原基因，通過反式互補(bǔ)作用，由表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細(xì)胞提供復(fù)制子載體缺失的結(jié)構(gòu)蛋白，從而包裝成假病毒顆粒，在包裝細(xì)胞中該假病毒顆?？梢垣@得放大培養(yǎng)。這種復(fù)制子載體系統(tǒng)的研究在近10年來也得到廣泛的發(fā)展，如DENV、YFV、WNV、KUNV、TBEV等的某些病毒株都開發(fā)有復(fù)制子載體。1997年，Khromykh等以 Kunjin病毒為研究對象，率先進(jìn)入黃病毒復(fù)制子載體研究領(lǐng)域，建立了以KUN為基礎(chǔ)的復(fù)制子載體系統(tǒng)[2,13]。在研究KUN亞基因組復(fù)制子性質(zhì)時發(fā)現(xiàn)，復(fù)制子的持續(xù)表達(dá)并未引起培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞病變，說明KUN的復(fù)制對宿主細(xì)胞無細(xì)胞毒性，使得黃病毒復(fù)制子非常適合作為表達(dá)外源基因的載體。在此基礎(chǔ)上，更多細(xì)致而深入的工作隨之開展[14-16]。

近幾年來，我們一直以JEV SA14-14-2株為基礎(chǔ)，開發(fā)研制JEV復(fù)制子載體系統(tǒng)，首先，我們構(gòu)建了 JEV復(fù)制子載體 pCTCJEV、pCTMJEV，證實了該載體在 BHK-21細(xì)胞中能夠自主復(fù)制并且表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白，插入的外源蛋白 EGFP能夠有效地得以表達(dá)[5]。在該復(fù)制子載體中，我們是將EGFP通過IRES偶聯(lián)的形式置于JEV基因組3′-UTR的末端構(gòu)建的雙順反子載體，由于IRES的存在，EGFP的表達(dá)量和復(fù)制子載體自主復(fù)制能力的相關(guān)性不能得到很精確的體現(xiàn)。為了提高試驗的嚴(yán)謹(jǐn)性，我們進(jìn)一步改造了JEV復(fù)制子，在復(fù)制子的結(jié)構(gòu)基因缺失處C基因與NS1基因之間添加了MCS，以方便外源基因的插入，同時添加了FMDV 2A順式水解元件序列以保證外源蛋白的正確切割，將外源基因和病毒的基因置于同一讀碼框內(nèi)。這樣避免了以往試驗中報告基因通過 IRES序列的偶聯(lián)插入到于 JEV 3′-UTR后，而不是位于JEV的讀碼框里，以非帽子依賴的翻譯形式進(jìn)行蛋白的表達(dá)。

在黃熱病毒復(fù)制子的系列研究中，得到的共識是用復(fù)制子載體來表達(dá)外源基因，報告基因的表達(dá)水平和復(fù)制子的復(fù)制能力成正相關(guān)關(guān)系，利用報告基因的表達(dá)水平來評價載體的復(fù)制水平可以取代煩瑣的檢測基因復(fù)制能力的工作，通過報告基因的表達(dá)可以更加客觀的評價 JEV復(fù)制子的自主復(fù)制能力，也使得復(fù)制子載體能成為一個評價整個黃熱病毒基因組復(fù)制的重要工具。如Lo等[17]利用WNV復(fù)制子插入的報告基因LUC來評價3′-UTR的突變和缺失對 WNV基因組復(fù)制能力的影響。本研究中，我們選用的Lac Z作為報告基因來判斷系列復(fù)制子載體的自主復(fù)制能力。

載體的大小和對外源基因的最大包容量是評價復(fù)制子載體實用性的一個重要指標(biāo)，我們在優(yōu)化JEV復(fù)制子載體時，一方面是盡可能地削減JEV基因組序列，在保留亞基因組的自主復(fù)制能力的前提下，盡可能減短結(jié)構(gòu)基因的序列，pCMW-2M 復(fù)制子載體是保留了C基因的全部序列，以此為基礎(chǔ)分別保留C23和C68位氨基酸，進(jìn)一步構(gòu)建了pCMW-2M-1LAC、pCMW-2M-3LAC；另一方面，由于EGFP基因相對較短，我們改構(gòu)了JEV復(fù)制子載體后，選擇了Lac Z基因，該基因長3 057 bp，觀察復(fù)制子載體能否容納較長的報告基因。將pCMW-2M-LAC轉(zhuǎn)染 BHK-21細(xì)胞后，經(jīng)過原位染色能夠觀察到 β-半乳糖苷酶的表達(dá)，證實了JEV復(fù)制子載體能夠表達(dá)較大的外源蛋白的能力，但是Lac Z陽性細(xì)胞率較低，不足 5%，這個結(jié)果和我們預(yù)期的結(jié)果相差較大，可能的原因有：1) JEV亞基因組本身的自主復(fù)制能力；2) 實驗操作等諸多因素的影響，比如轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞的敏感程度、細(xì)胞的生長狀態(tài)等。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在Pang報道的DEN-2復(fù)制子載體中，用IFA檢測復(fù)制子表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白的陽性細(xì)胞率不足1%[18]。

復(fù)制子載體能夠在敏感細(xì)胞中自主復(fù)制自身基因組，但是由于缺乏結(jié)構(gòu)蛋白，所以不能包裝成完整的病毒顆粒。為了檢測構(gòu)建的JEV復(fù)制子載體能否在表達(dá)JEV結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞系中包裝成假病毒顆粒PIPs，我們將pCMW-2M-LAC轉(zhuǎn)染到CME-4細(xì)胞系中，結(jié)果在CME-4細(xì)胞系中，約20%左右的細(xì)胞表達(dá) β-半乳糖苷酶，并且細(xì)胞藍(lán)染明顯，陽性細(xì)胞率提高了4～10倍。將收獲的上清再次感染CME-4細(xì)胞系后，至第二代時，感染細(xì)胞系約有50%的細(xì)胞表達(dá) β-半乳糖苷酶，陽性細(xì)胞數(shù)目增加，表達(dá)量與第一代相當(dāng)；而用第一代的培養(yǎng)上清感染正常的BHK-21細(xì)胞，陽性率沒有進(jìn)一步增加，表達(dá)量也相對較弱。第 3代感染細(xì)胞系后陽性細(xì)胞占到一半以上，但從染色結(jié)果看表達(dá)量要少于第二代。進(jìn)一步將第3代細(xì)胞上清再次感染CME-4細(xì)胞系后，染色結(jié)果卻顯示陽性細(xì)胞數(shù)減少至20%左右，且表達(dá)量有所下降。在進(jìn)一步的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)假病毒顆粒能夠傳代2～3次。根據(jù)第一代感染結(jié)果，計算假病毒顆粒的滴度為1.2×103U/mL，第二代感染結(jié)果計算得到的假病毒顆粒滴度約為1×104U/mL。

在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，pCMW-2M-1Lac、pCMW-2M-3Lac始終和 pCMW-2M-LAC保持很高的一致性，即JEV復(fù)制子載體保留23位的C蛋白氨基酸殘基，其復(fù)制子載體依舊保留有自主復(fù)制能力，并且能夠表達(dá)至少長約3 kb的外源基因。另外我們發(fā)現(xiàn)在PIPs傳至第3代時，報告基因表達(dá)量有所降低，提示我們攜帶報告基因Lac Z的假病毒顆粒在傳代過程中有可能出現(xiàn)報告基因的丟失，有相關(guān)報道提示，在PIPs存在下，復(fù)制子在傳代過程中選擇壓力導(dǎo)致外源基因丟失，使報告基因表達(dá)量急劇下降。Fayzuli等[19]在建立WNV復(fù)制子表達(dá)系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)，將包含報告基因的復(fù)制子載體在包裝細(xì)胞系上傳代時，一代后就有90%以上的報告基因丟失，但是PIPs仍可持續(xù)存在?？紤]原因可能為在缺乏外源基因的情況下，復(fù)制子可維持相對高的復(fù)制水平，經(jīng)過幾輪傳代后，包含報告基因的復(fù)制子全部失去，而單純的復(fù)制子更加適合擴(kuò)增。插入小片段的報告基因是否更加穩(wěn)定，得到的PIPs能否穩(wěn)定傳代，這類問題在今后的實驗中仍需深入研究。本研究初步探索了JEV復(fù)制子載體系統(tǒng)，優(yōu)化了原來的JEV復(fù)制子載體，并且證實了包裝大片段Lac Z外源基因的復(fù)制子假病毒顆粒的獲得，為進(jìn)一步開發(fā)以乙腦病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的疫苗載體系統(tǒng)打下基礎(chǔ)。

致謝：特別感謝中國藥品生物制品檢定所疫苗一室俞永新院士、董關(guān)木研究員、賈麗麗研究員提供實驗技術(shù)方面的指導(dǎo)。

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Influence of Japanese enciphalitis virus capsid protein on the self-replicate ability of JEV replicon vectors

Ying Huang1*, Shan Liu2*, Peng Yang1, Chao Wang1, Yun Du1, Zhiwei Sun1, and Weiyuan Yu1

1Laboratory for Protein Engineering,Institute of Biotechnology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing100071,China
2The Pathology Department,General Hospital of the Second Artillery of Chinese PLA,Beijing100088,China

Received:February 3, 2010;Accepted:May 20, 2010

Corresponding author:Weiyuan Yu. Tel: +86-10-66948877; E-mail: yeyelaitao@sina.com*These authors contributed equally to this study.