尹文偲，胡勇，金梅林

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

動(dòng)物及獸醫(yī)生物技術(shù)

利用酵母雙雜交系統(tǒng)在人腦cDNA文庫(kù)中篩選與禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白質(zhì)

尹文偲，胡勇，金梅林

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

禽流感病毒核蛋白 (NP) 在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及決定病毒的宿主特異性方面都具有重要作用。通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與核蛋白相互作用的蛋白，為進(jìn)一步了解NP蛋白與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互關(guān)系以及流感病毒與宿主的相互關(guān)系奠定基礎(chǔ)。應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建NP誘餌質(zhì)粒，進(jìn)而篩選人腦cDNA文庫(kù)，尋找可能與禽流感病毒NP相互作用的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)酵母雙雜交共驗(yàn)證，得到7個(gè)與NP相互作用的陽(yáng)性克隆。該結(jié)果為深入了解病毒復(fù)制的分子機(jī)理及其在蛋白質(zhì)水平上與宿主蛋白的相互作用關(guān)系提供了線索。

禽流感病毒核蛋白，人腦cDNA文庫(kù)，酵母雙雜交系統(tǒng)，蛋白間相互作用

Abstract:Avian influenza virus Nucleoprotein (NP) is important in viral transcription, replication and determining host specificity of influenza virus. Yeast two-hybrid technique was applied to screen for proteins interacting with virus nucleoprotein, so as to further elucidate the interaction between virus nucleoprotein and cellular proteins, as well as the interaction between virus and host. To explore new proteins interacted with NP protein, a human brain cDNA library was screened using yeast two-hybrid system with NP as the bait. DNA inserts of the positive AD/library plasmids were sequenced. By the BLAST analysis against the GenBank databases seven positive clones resulted in seven genes. Our results could help for the further study on the molecular mechanism of virus replication, transcription and protein-protein interaction. Further investigations were needed to characterize these interactions.Keywords: Avian influenza virus Nucleoprotein, human brain cDNA library, yeast two-hybrid system, protein-protein interaction

禽流感 (Avian influenza，AI) 是由A型流感病 毒引起的家禽和/或野禽的一種疾病綜合癥[1]。禽流感病毒 (Avian influenza virus，AIV) 屬A型流感病毒，主要引起禽類以呼吸系統(tǒng)疾病、產(chǎn)蛋下降乃至急性致死的高死亡率等為特征的烈性傳染病，常給養(yǎng)禽業(yè)主造成毀滅性打擊[2]。AIV的基因組為單股負(fù)鏈RNA，含有大小不同的8個(gè)獨(dú)立的RNA片段，流感病毒核蛋白 (Nucleoprotein，NP) 是病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由第 5節(jié)段的NP基因編碼，該節(jié)段含1 565個(gè)核苷酸，編碼498個(gè)氨基酸，分子量為56 kDa，pH 6.5時(shí)帶正電荷。對(duì)從不同宿主分離的病毒株進(jìn)行分析表明，核蛋白基因相當(dāng)保守，氨基酸差別不超過(guò)11%。

遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究顯示，禽流感病毒 NP在病毒的感染周期中具有重要作用。在病毒的RNA合成過(guò)程中，NP對(duì)病毒從轉(zhuǎn)錄模式轉(zhuǎn)換成復(fù)制模式具有重要的作用。體內(nèi)和體外病毒感染實(shí)驗(yàn)均證明，缺乏可溶性的NP，病毒將不能從轉(zhuǎn)錄向復(fù)制模式轉(zhuǎn)換[3]。流感病毒NP的磷酸化能增強(qiáng)流感病毒的增殖能力，而這種磷酸化是由宿主細(xì)胞來(lái)完成的，不同的宿主其磷酸化能力不同，從而影響了流感病毒感染宿主的范圍[4]。NP與病毒組 RNA及病毒聚合酶的3個(gè)亞單位 PB1、PB2、PA相連，參與 RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，在與病毒顆粒RNA節(jié)段相互作用中充當(dāng)骨架，形成核糖核蛋白復(fù)合體 (RNP)，影響病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)功能。NP富含精氨酸、甘氨酸和絲氨酸殘基，這個(gè)結(jié)構(gòu)有利于 NP 結(jié)合RNA[5]，而AIV的復(fù)制需要NP與RNA結(jié)合。

NP能在細(xì)胞漿與細(xì)胞核間穿梭，它可以與細(xì)胞多肽如肌動(dòng)蛋白相互作用，對(duì)禽流感病毒核衣殼蛋白復(fù)合體以及相關(guān)蛋白的出核運(yùn)輸有較為重要的作用[6]。

NP蛋白不僅在流感病毒的復(fù)制及感染方面起重要作用，它還是決定病毒的宿主特異性的一個(gè)重要蛋白?，F(xiàn)在對(duì)于NP蛋白是如何與RNA結(jié)合，NP蛋白與細(xì)胞內(nèi)哪些蛋白質(zhì)存在相互作用以及流感病毒與宿主的相互關(guān)系仍知之甚少。

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)互相作用和蛋白質(zhì)功能的一種新技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的諸多領(lǐng)域[7]。酵母的遺傳能力及易操作性使得通過(guò)它可以低成本高通量地評(píng)估蛋白間的相互作用。通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)從人腦cDNA文庫(kù)中篩選與已知病毒即禽流感病毒蛋白NP相互作用的蛋白質(zhì)，以期進(jìn)一步了解禽流感病毒 NP在病毒的感染周期中的作用，并為理解病毒復(fù)制的分子機(jī)理以及在蛋白質(zhì)水平上與宿主蛋白相互作用的關(guān)系提供線索。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒及文庫(kù)

大腸桿菌E. coliDH5α為本室保存。酵母菌株AH109和Y187、誘餌質(zhì)粒pGBKT7、pGADT7以及人腦cDNA文庫(kù)購(gòu)自Clontech公司。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

按禽流感病毒NP基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，以pcDNA3.1-NP[8](由本實(shí)驗(yàn)室周紅波副教授贈(zèng)送)為模板，PCR擴(kuò)增NP基因全長(zhǎng)，分別在上游和下游引物上引入EcoRⅠ及SalⅠ酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ酶切，回收后與經(jīng)相同條件酶切回收后的pGBKT7載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-NP，酶切鑒定后，測(cè)序鑒定。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌AH109

重組質(zhì)粒 pGBKT7-NP鑒定正確后，按照Clontech公司Yeast transformation system操作手冊(cè)，應(yīng)用 PEG/LiAC方法轉(zhuǎn)化酵母菌 AH109 (記為AH109 (pGBKT7-NP))，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于SD/-Trp平板，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、直徑 2～3 mm的菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)。

1.4 以 pGBKT7-NP為誘餌篩選正常人腦 cDNA文庫(kù)

1.4.1NP蛋白的毒性檢驗(yàn)與自激活檢驗(yàn)

分別將質(zhì)粒 pGBKT7以及 pGBKT7-NP和pGADT7 (共轉(zhuǎn)化) 轉(zhuǎn)化AH109酵母菌，將它們連同AH109 (pGBKT7-NP) 菌液分別涂平板培養(yǎng)后挑選直徑約3 mm的菌落，分別接種于500 μL 2× YPDA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 h后，稀釋10倍。將稀釋后的3種菌液以100 μL/平板各自分別涂于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu和 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板，觀察它們?cè)诟髌桨迳系纳L(zhǎng)情況。

1.4.2人腦cDNA文庫(kù)的篩選

挑取一直徑 2～3 mm、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的AH109(pGBKT7-NP) 菌落接種于20 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃、270 r/min振搖10～20 h，測(cè)得OD600值為0.2后，將此時(shí)的菌轉(zhuǎn)接于含45 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基的 500 mL錐形瓶，30℃、270 r/min振搖 8 h，測(cè)得OD600值為 0.8。離心后用 4～5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基將菌液沉淀重懸，與1 mL含正常人腦文庫(kù)的Y187酵母菌液共同接種于50 mL 2×YPDA/Kan液體培養(yǎng)基，在 2 L錐形瓶中 30℃、30～40 r/min振搖過(guò)夜溫育20 h，倒置顯微鏡觀察二倍體形成情況，如看到三葉草狀的二倍體細(xì)胞，則繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)物離心，重懸于10 mL 0.5×YPDA培養(yǎng)基，取100 μL用于接合效率的檢測(cè)，剩下的菌液按 200 μL/平板全部涂于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板，30℃倒置培養(yǎng)，直至菌落出現(xiàn)。

1.4.3接合效率檢測(cè)

如上所述，1.4.2中接合酵母的培養(yǎng)物重懸液取100 μL 按 1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000 稀釋，稀釋后每個(gè)稀釋度按 100 μL/平板分別涂于SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Trp/-Leu平板，培養(yǎng)后計(jì)算 SD/-Trp和 SD/-Leu平板之中菌落數(shù)較少的平板的菌落個(gè)數(shù)以及SD/-Trp/-Leu平板上的菌落個(gè)數(shù)。

1.5 假陽(yáng)性克隆的鑒定與排除

1.5.1酵母質(zhì)粒的營(yíng)救

將 1.4.2中得到的陽(yáng)性克隆接種于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于LB/Amp平板，挑菌擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提純化質(zhì)粒。

1.5.2陽(yáng)性蛋白的自激活檢驗(yàn)

將上一步驟得到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒與 pGBKT7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌 AH109，然后挑取直徑為 2～3 mm的菌落接種于500 μL 2× YPDA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 h后，稀釋10倍。稀釋后的菌液以100 μL/平板分別涂布 SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板，觀察生長(zhǎng)情況。

1.5.3回復(fù)雜交

將 1.5.2得到的未自激活的陽(yáng)性克隆與重組的pGBKT7-NP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-Gal平板，不能生長(zhǎng)的克隆作為假陽(yáng)性排除，而生長(zhǎng)為藍(lán)色單菌落的為陽(yáng)性克隆。

1.6 基因序列的測(cè)定與分析

篩選得到的文庫(kù)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定后，將所得基因序列在 NCBI網(wǎng)站上 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 進(jìn)行BLAST分析。

2 結(jié)果

2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NP的構(gòu)建

重組質(zhì)粒 pGBKT7-NP經(jīng)酶切并測(cè)序鑒定。結(jié)果表明插入的NP基因序列及插入方向完全正確。酶切鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 pGBKT7-NP重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Electrophoresis identification of pGBKT7-NP recombinant plasmids by restriction endonuclease digestion. 1:DNA marker; 2: pGBKT7-NP vector digested byEcoRⅠ andSalⅠ.

2.2 人腦cDNA文庫(kù)篩選

2.2.1NP蛋白對(duì)宿主無(wú)毒性且無(wú)自激活

將大小相近的轉(zhuǎn)化有 pGBKT7質(zhì)粒的 AH109菌落和 AH109(pGBKT7-NP) 菌落分別在 3 mL YPDA液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，A600分別為 1.20和1.24，表明NP蛋白對(duì)酵母菌沒(méi)有毒性，不影響酵母菌正常生長(zhǎng)。pGBKT7-NP和 pGADT7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的AH109菌株在SD/-Trp和SD/-Trp/-Leu平板能夠生長(zhǎng)且菌落呈白色，而在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板不能生長(zhǎng)，表明NP蛋白不存在自激活效應(yīng)。

2.2.2酵母接合

培養(yǎng)20 h后，在倒置顯微鏡下觀察到了三葉草狀二倍體細(xì)胞，說(shuō)明酵母接合培養(yǎng)成功。

2.2.3接合效率

SD/-Leu平板 (1∶10 000稀釋) 菌落數(shù)為87個(gè)，SD/-Trp/-Leu平板 (1∶1 000稀釋) 菌落數(shù)為28個(gè)，接合效率為 (28×104/87×105)×100%=3.2%，符合文庫(kù)篩選要求。

2.3 假陽(yáng)性的排除

在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上共挑取233個(gè)克隆，應(yīng)用大腸桿菌DH5α擴(kuò)增并經(jīng)LB/Amp篩選獲得文庫(kù)質(zhì)粒后，將這些候選質(zhì)粒和pGBKT7共轉(zhuǎn)化AH109菌株以檢測(cè)這些陽(yáng)性克隆的自激活，結(jié)果轉(zhuǎn)化菌在 SD/-Trp/-Leu平板上能夠生長(zhǎng)且菌落呈白色，而在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上不能生長(zhǎng)，這表明候選蛋白不存在自激活效應(yīng)。

將這些候選質(zhì)粒與pGBKT7-NP共轉(zhuǎn)化AH109酵母進(jìn)行回復(fù)雜交，總共篩選得到 7種顯色的陽(yáng)性克隆 (圖 2)。

2.4 基因序列的測(cè)定與分析

將篩選得到的陽(yáng)性克隆測(cè)序后進(jìn)行 BLAST分析，最終鑒定出7種與NP相互作用的蛋白 (表1)。這 7種蛋白分別為蛋白精氨酸 N-甲基轉(zhuǎn)移酶 1(Protein arginine methyltransferase 1)，網(wǎng)格蛋白(Clathrin)，肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶 Pin1 (Protein interaction with NIMA1)，鋅指蛋白668 (Zinc finger protein 668)，HIF缺氧誘發(fā)因子-1，微管相關(guān)蛋白MAP1A (Microtubule-associated protein 1A) 及微管相關(guān)蛋白 MAP1B (Microtubule-associated protein 1B)。其中蛋白精氨酸 N-甲基轉(zhuǎn)移酶 1相同克隆出現(xiàn)5次，微管相關(guān)蛋白MAP1B相同克隆出現(xiàn)3次，其余都只有1個(gè)克隆。

圖2 X-Gal顯色反應(yīng)結(jié)果Fig.2 X-Gal filter assay analysis result.

表1 BLAST結(jié)果Table 1 Result of BLAST

3 討論

通過(guò)酵母雙雜交篩選到的與已知蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，往往其功能密切相關(guān)，彼此相互調(diào)節(jié)，共同參與某些生理或病理過(guò)程，這可以加深對(duì)各種生物現(xiàn)象分子機(jī)理的理解，以及對(duì)基因作用機(jī)制的了解。本研究以 pGBKT7-NP質(zhì)粒為誘餌質(zhì)粒，應(yīng)用酵母雙雜交的方法篩選人腦cDNA文庫(kù)，得到與禽流感病毒NP相互作的 7種蛋白質(zhì)，并在酵母細(xì)胞中初步驗(yàn)證了它們的相互作用。

在這篩選到的幾種蛋白質(zhì)中，蛋白精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶1廣泛存在于生物體內(nèi)，主要定位于細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)許多重要的生理環(huán)節(jié)，如參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、RNA加工、核運(yùn)輸、DNA修復(fù)損傷和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。鋅指蛋白 668與轉(zhuǎn)錄相關(guān)，可以選擇性地結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，鋅指蛋白在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用。HIF缺氧誘發(fā)因子-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞的缺氧起穩(wěn)定作用。上述幾種蛋白都是與轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)的蛋白質(zhì)，這提示了 NP在病毒復(fù)制過(guò)程中可能有一定的作用。

肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶Pin1在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，是多個(gè)致癌信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子，可加強(qiáng)和催化多種致癌信號(hào)，使其無(wú)限放大，最終引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖失控。Pin1能特異性地催化磷酸化后的蘇/絲氨酸-脯氨酸酰胺鍵的旋轉(zhuǎn)，從而改變磷酸化蛋白質(zhì)的構(gòu)象，影響蛋白質(zhì)的生理功能。如：蛋白的催化活性、磷酸化狀況、蛋白-蛋白互作、亞細(xì)胞定位和蛋白的穩(wěn)定性等[10]。Pin1是目前磷酸化后調(diào)節(jié)機(jī)制研究的一個(gè)熱門蛋白質(zhì)。而A型流感病毒的NP以兩種形式存在，磷酸化形式的NP可以移入核內(nèi)，另一種是一直留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的非磷酸化形式。NP的磷酸化和宿主細(xì)胞有直接的關(guān)系，而NP磷酸化后的修飾有可能與Pin1相關(guān)。

網(wǎng)格蛋白 Clathrin在胞膜上各種不同的運(yùn)輸和信號(hào)作用過(guò)程中都扮演一個(gè)必不可少的角色，它在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程中所起的很多作用也開始浮現(xiàn)出來(lái)。網(wǎng)格蛋白是所有真核細(xì)胞 (從酵母到人) 胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)倪\(yùn)載工具，具有輔助細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)吞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要功能[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道流感病毒進(jìn)入細(xì)胞是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[12]。

微管結(jié)合蛋白 (Microtubule-associated proteins，MAPs) 在細(xì)胞內(nèi)與微管特異地結(jié)合，是與微管的空間分布密切相關(guān)的纖維蛋白的總稱[13]。MAP1A和MAP1B屬于MAPs家族，MAPs對(duì)微管的功能起輔助作用。帶負(fù)電的微管蛋白結(jié)合的位點(diǎn)含有幾個(gè)Lys-Lys-Glu-X這樣的重復(fù)氨基酸序列。這些位點(diǎn)能中和微管中微管蛋白間的電荷，以維持聚合體的穩(wěn)定。NP可以與細(xì)胞多肽相互作用，MAP1A和MAP1B與NP的相互作用進(jìn)一步提示了這一作用。這些候選結(jié)合蛋白與靶蛋白結(jié)合的可靠性需要進(jìn)一步通過(guò)哺乳細(xì)胞雙雜交、免疫共沉淀等方法研究證實(shí)。

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Screening of proteins interacting with avian influenza virus Nucleoprotein by yeast two-hybrid system in human brain cDNA library

Wensi Yin, Yong Hu, and Meilin Jin

State Key Laboratory of Agricultural Microbiology,College of Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,China

Received:February 22, 2010;Accepted:May 31, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2010CB534000), National Transgenic Major Program (No.2009ZX08009-141B), Important National Science and Technology Specific Projects (Nos. 2008ZX10403, 2009ZX10004-109).

Corresponding author:Meilin Jin. Tel: +86-27-87286905; Fax: +86-27-87282608; E-mail: jml8328@126.com

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2010CB534000)，轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (No. 2009ZX08009-141B)，國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題 (Nos. 2008ZX10403, 2009ZX10004-109) 資助。