王楨，羅軍，王偉，趙旺生，林先滋

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室，楊凌 712100

組織工程與細(xì)胞培養(yǎng)

奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

王楨，羅軍，王偉，趙旺生，林先滋

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室，楊凌 712100

應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法和高密度培養(yǎng)、連續(xù)傳代法建立西農(nóng)薩能奶山羊乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，通過生長曲線繪制、核型分析、免疫熒光染色 (角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白)、油紅染色及β-酪蛋白基因的RT-PCR分析進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞鑒定。實驗結(jié)果表明細(xì)胞生長曲線為典型的S型，染色體數(shù)目眾數(shù)為60，細(xì)胞角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白表達(dá)均呈陽性，油紅染色后可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的脂滴，且細(xì)胞表達(dá)酪蛋白 mRNA。說明運用本方法培養(yǎng)的細(xì)胞為正常的乳腺上皮細(xì)胞，并具有一定的泌乳功能。

奶山羊，乳腺上皮細(xì)胞，原代培養(yǎng)

Abstract:Based on thein vitroculturing system developed for epithelial cells in mammary gland of Xinong Saanen dairy goats using tissue explant culture, high density cultivation, and continuous passaging, the cultured epithelial cells were evaluated by growth curve fitting, karyotype analysis, immunofluorescence staining (keratin, epithelial membrane antigen (EMA), vimentin, β-casein), oil red staining and RT-PCR of β-casein gene. The results showed that the growth of epithelial cells with the model number of chromosome of 60 demonstrated a typical ‘S’ shape curve, the positive gene expression of keratin, EMA, vimentin and β-casein was detected, the cytoplasmic lipid droplets were observed following the oil red staining, the cultured cells expressed the mRNA of β-casein. In conclusion, the currentin vitroculturing system can obtain the normal mammary gland epithelial cells with the function of secretion.

Keywords:dairy goat, mammary gland epithelial cell, primary culture

乳腺是哺乳動物少數(shù)可以重復(fù)經(jīng)歷生長、功能分化和退化過程的器官之一。由于乳腺較強(qiáng)的分泌功能，可以使外源基因在乳腺中表達(dá)后隨乳汁流出，乳腺上皮細(xì)胞成為轉(zhuǎn)基因研究中重要的靶細(xì)胞。奶山羊是轉(zhuǎn)基因動物研究的良好模型。根據(jù)羊奶與牛奶成分不同[1-2](如：羊奶短中鏈脂肪酸含量比牛奶高且脂肪球直徑小)，推測山羊乳腺上皮細(xì)胞的乳成分合成及調(diào)控機(jī)制與牛不同，然而目前關(guān)于山羊泌乳的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)對于研究乳腺生長發(fā)育及闡明泌乳機(jī)制有重要意義，同時也為轉(zhuǎn)基因研究中構(gòu)建乳腺上皮細(xì)胞特異性表達(dá)載體提供有效模型。

本試驗首次采用高密度培養(yǎng)、連續(xù)傳代法對山羊乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，克服了常規(guī)培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的難消化、潛伏期長等問題，獲得了大量的乳腺上皮細(xì)胞，通過生長曲線繪制、核型分析、免疫熒光染色、酪蛋白檢測、油紅染色等鑒定了所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中研究脂肪酸、乳糖代謝等網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制及建立轉(zhuǎn)基因打靶細(xì)胞模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1乳腺組織

以西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能羊原種場健康的純種西農(nóng)薩能羊 (泌乳天數(shù)為40 d) 為實驗材料，手術(shù)法采集乳腺腺泡組織樣品。

1.1.2主要試劑

DMEM/F-12、胰蛋白酶、表皮生長因子 (EGF)、Trizol購自美國Invitrogen公司；胎牛血清(FBS) 購自天津灝洋生物制品技術(shù)有限公司；胰島素、氫化可的松、催乳素購自Sigma公司；角蛋白(Keratin) 抗體、波形蛋白(Vimentin) 抗體、上皮膜抗原 (EMA)抗體、β-酪蛋白(β-Casein) 抗體、SABC-Cy3免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其他常規(guī)藥品及試劑均為國產(chǎn)。

1.1.3主要儀器

CO2培養(yǎng)箱 (Thermo)；熒光相差顯微鏡(Leica)；冷凍離心機(jī) (Thermo)；普通倒置顯微鏡 (國產(chǎn)) 等。

1.2 方法

1.2.1乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)

采用組織塊培養(yǎng)法，具體參見曹艷紅等[3]的研究。

1.2.2乳腺上皮細(xì)胞的純化及傳代培養(yǎng)

利用成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞消化和貼壁的速率不同進(jìn)行純化，具體方法參考鄭月茂等[4-5]的研究。經(jīng)過4～6代即可得到純化的乳腺上皮細(xì)胞。

純化的乳腺上皮細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)，具體方法：當(dāng) 60 mm皿培養(yǎng)的細(xì)胞生長匯合至 95%左右(約 1.6×106～2.0×106個) 時，將培養(yǎng)基吸出，加入消化液，置培養(yǎng)箱內(nèi)37℃消化3～5 min，在倒置顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞回縮變圓、將要脫落時將消化液吸出，加入培養(yǎng)基，反復(fù)吹打使大部分細(xì)胞脫落，吸出 2/3左右的培養(yǎng)基 (約0.7×106～1.0×106個細(xì)胞)，離心后凍存 (90%血清，10% DMSO)。在原皿中補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第2天，細(xì)胞可生長匯合至95%左右，重復(fù)上述過程。

1.2.3細(xì)胞生長曲線

取第 20代乳腺上皮細(xì)胞以 3.2×104個細(xì)胞/孔的量接種于 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天同一時間對 3孔細(xì)胞分別計數(shù)，求平均值，連續(xù)9 d。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，3孔細(xì)胞的平均數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.4染色體核型分析

待細(xì)胞 (20代) 生長匯合至50%時，秋水仙素處理6 h，消化為單細(xì)胞懸液，0.1 mol/L的KCl溶液低滲處理20 min，離心后用醋酸/甲醇 (1∶3) 固定，滴片后50℃烤片2 h，吉姆薩染液染色。

1.2.5免疫熒光染色

將細(xì)胞接種到24孔板中，分別進(jìn)行角蛋白、波形蛋白、上皮膜抗原、β-酪蛋白免疫熒光染色，具體方法參照試劑盒說明書，操作完成后用Hoechst33342染核。一抗為單克隆鼠抗羊角蛋白抗體、單克隆鼠抗羊波形蛋白抗體、單克隆兔抗人上皮膜抗原抗體，單克隆兔抗羊 β-酪蛋白抗體，二抗為羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG。

1.2.6RT-PCR檢測β-酪蛋白表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 (擴(kuò)增長度 300 bp)。上游引物：5′-ACAGCCTCCCACAAAACATCC-3′；下游引物：5′-TGAGAAAGGGACAGCACGGA-3′。擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 4 min ；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7油紅染色

在35 mm皿接種適量細(xì)胞，培養(yǎng)至第8天進(jìn)行油紅染色。方法如下：10%福爾馬林預(yù)固定、40%福爾馬林固定 1 h以上，用超純水、60%異丙醇漂洗。干燥后加入1 ml 油紅染液室溫孵育15 min，超純水洗數(shù)次，最后用Hoechst33342染核，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和純化

原代培養(yǎng)至第10天有大量乳腺上皮細(xì)胞遷出，胰酶消化，鏡下可見細(xì)胞收縮變圓，與組織塊分離(圖1A)。經(jīng)過3～5代的純化培養(yǎng)，可以初步分離得到較純的乳腺上皮細(xì)胞 (圖1B)。有的可形成閉合型細(xì)胞群，呈島嶼狀生長 (圖 1C)。60代依然保持增殖活力及良好的細(xì)胞形態(tài) (圖 1D)。90代左右開始凋亡，鏡下可見細(xì)胞由于細(xì)胞質(zhì)融合而出現(xiàn)大量多核現(xiàn)象 (圖 1E)。

圖1 奶山羊乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.1 Morphologiacal observation of the cultured mammary epithelial cells. (A) Mammary epithelial cells digested from the tissue fragment (50×). (B) Purified mammary epithelial cells (50×). (C) The island monolayer aggregate of mammary epithelial cells (50×).(D) 60th passage mammary epithelial cell (200×). (E) 90th passage mammary epithelial cell, the arrow indicates the multiple nucleuses in one cell (200×). (F) The fried-egg shape mammary epithelial cell in low density, as indicated by arrows (50×).

2.2 細(xì)胞生長曲線

以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，三孔細(xì)胞數(shù)的平均值為縱坐標(biāo)繪制山羊乳腺上皮細(xì)胞生長曲線 (圖 2)。結(jié)果顯示：山羊乳腺上皮細(xì)胞生長延滯期0～3 d，對數(shù)生長期4～7 d，7 d后進(jìn)入平臺期，呈典型的S型，符合細(xì)胞生長的一般生物學(xué)規(guī)律。

2.3 染色體核型分析

對第20代的乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行核型分析，大多數(shù)細(xì)胞染色體數(shù)目為60。其核型與山羊染色體圖譜一致，說明所培養(yǎng)的細(xì)胞染色體未發(fā)生明顯的變異(圖 3)。

圖2 奶山羊乳腺上皮細(xì)胞生長曲線Fig.2 Mammary gland epithelial cell growth curve of dairy goat.

圖3 奶山羊乳腺上皮細(xì)胞染色體核型 (1 000×)Fig.3 Karyotype of mammary gland epithelial cell (1 000×).

2.4 免疫熒光染色

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞角蛋白、上皮膜抗原、β-酪蛋白的表達(dá)均呈紅色陽性，細(xì)胞核為藍(lán)色；與國內(nèi)多數(shù)報道不同，波形蛋白的表達(dá)亦呈陽性，且呈絲狀均勻分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi) (圖 4)。

圖4 乳腺上皮細(xì)胞免疫熒光鑒定 (200×)Fig.4 Immunofluorescence of the mammary gland epithelial cell momolayer (200×). (A) Positive staining of Keratin, as shown in arrow. (B) Positive staining of EMA, as indicated in arrow. (C) Positive staining of Vimentin, the arrow indicates positive staining. (D) Positive staining of β-Casein, the arrow shows positive staining.

2.5 酪蛋白檢測

電泳結(jié)果顯示在300 bp處出現(xiàn)了目的條帶，說明細(xì)胞表達(dá)了β-酪蛋白基因 (圖5)。

2.6 油紅染色

顯微鏡下可見大量大小不等的脂滴彌散于整個細(xì)胞質(zhì)內(nèi) (圖6A)；細(xì)胞生長密集的地方還可觀察到乳球體，每個乳球體含較多脂滴，Hoechst33342染核后可見乳球體由大量細(xì)胞聚集而成 (圖6B)。

圖5 β-酪蛋白電泳檢測Fig.5 RT-PCR analysis of β-casein gene. A: DL2000 marker;B: PCR product of β-casein gene.

圖6 乳腺上皮細(xì)胞油紅染色 (200×)Fig.6 Oil red staining of the mammary gland epithelial cell(200×). (A) Monolayer stained with oil red, lipid droplet in cytoplasm is stained red. (B) Dome structure stained with oil red and Hoechst33324, lipid droplet is stained red, the nucleus is stained blue.

3 討論

盡管一般來講，細(xì)胞培養(yǎng)的 2個連續(xù)代次之間應(yīng)間隔至少2 d，使細(xì)胞在被胰酶損傷后得到充分的恢復(fù)[6]。但體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞貼壁非常牢固，且隨著傳代間隔時間的延長，所需消化時間越長。長時間的消化不僅會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，而且使終止消化的時機(jī)難以掌握。另一方面，據(jù)筆者觀察，傳代的乳腺上皮細(xì)胞在低密度培養(yǎng)時常體積變大，呈煎蛋形 (圖1F)，而以高密度培養(yǎng)時細(xì)胞保持鋪路石狀，形態(tài)變化明顯得到改善，且在200倍鏡下可見細(xì)胞之間形成的連接 (圖 4)，這與國外的相關(guān)報道一致[7-8]。有報道高密度培養(yǎng)對原代軟骨細(xì)胞去分化有抑制作用[9]，然而在乳腺上皮細(xì)胞上的相關(guān)研究還未見報道。筆者用這種方法培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞不僅形態(tài)整齊良好，而且具有很強(qiáng)的增殖活力，與低密度培養(yǎng)、3～5 d傳代一次的乳腺上皮細(xì)胞 (20代左右凋亡，歷時約 80 d) 相比，這些細(xì)胞可在體外連續(xù)培養(yǎng)120 d左右 (60代以前可每天傳代，60代以后隨著細(xì)胞走向衰老傳代間隔時間相應(yīng)延長)。

角蛋白是上皮細(xì)胞的標(biāo)志，波形蛋白是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志[10]。正常的乳腺上皮細(xì)胞同時表達(dá)角蛋白和波形蛋白的報道十分少見。國外 Mark等[11]用添加霍亂毒素、表皮生長因子、胰島素、氫化可的松等的培養(yǎng)液培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，36%的細(xì)胞同時表達(dá)波形蛋白和角蛋白。Dairkee等[12]則發(fā)現(xiàn)，在乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)早期 (第4天)，所有的乳腺上皮細(xì)胞同時表達(dá)波形蛋白和角蛋白。這些報道限于培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中的某一小部分或某一時期。在本實驗中，所有乳腺上皮細(xì)胞可長期表達(dá)角蛋白和波形蛋白。從形態(tài)來看，細(xì)胞呈典型的鋪路石狀，與成纖維細(xì)胞明顯不同；從免疫組化的結(jié)果來看，細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞特有的角蛋白、上皮膜抗原；此外，細(xì)胞合成酪蛋白，可形成乳球體，且油紅染色可見細(xì)胞內(nèi)脂滴，說明細(xì)胞有一定的泌乳特性，這些都是成纖維細(xì)胞所不具有的。因此認(rèn)為高密度培養(yǎng)、連續(xù)傳代法適用于山羊乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。采用這種培養(yǎng)方法可以獲得足夠數(shù)量的、增殖活力良好的種子細(xì)胞，為進(jìn)一步研究泌乳機(jī)制和建立轉(zhuǎn)基因打靶細(xì)胞模型提供參考。

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Characterization and culture of isolated primary dairy goat mammary gland epithelial cells

Zhen Wang, Jun Luo, Wei Wang, Wangsheng Zhao, and Xianzi Lin

College of Animal Science and Technology,Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture,Northwest A&F University,Yangling712100,China

Received:January 13, 2010;Accepted:April 12, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2008AA10z135), Key Special Project for Breeding and Cultivation of GMO Varieties (No. 2009ZX08009-162B), R&D Special Fund for Public Welfare Industry (Agriculture) (No. 3-45).

Corresponding author:Jun Luo. Tel: +86-29-87082891; E-mail: luojun1@yahoo.com

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2008AA10z135)，轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項 (No. 2009ZX08009-162B)，公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè)) 科研專項經(jīng)費項目 (No. 3-45) 資助。