徐建超 章世元 全麗萍 謝月華 韓莉娜 侯文博

中國(guó)是生豬資源大國(guó)，產(chǎn)品肝素鈉原料資源豐富，是世界上肝素鈉主要出口國(guó)之一。目前我國(guó)主要以豬小腸粘膜為原料，提取的肝素鈉（任紅媛等，2007）抗凝活性高，在國(guó)際市場(chǎng)上頗受歡迎。肝素在組織內(nèi)和其它粘多糖一起以共價(jià)鍵的形式與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，需進(jìn)行水解使其解離下來(lái)（江燕等，2001），故該廢水是一種高鹽、高氮的高濃度有機(jī)廢水，含豐富的腸膜蛋白，目前鹽解法廠(chǎng)家可獲得腸膜蛋白粉，酶解法中的腸膜蛋白則隨污水排放。據(jù)侍愛(ài)秋（2002）的報(bào)道推算，我國(guó)肝素加工廢水年排放量約64.2萬(wàn)噸，粗略估計(jì)含粗蛋白量高達(dá)4 333.5 t，數(shù)量可觀(guān)。目前，許多企業(yè)以?xún)?yōu)質(zhì)蛋白為原料，應(yīng)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)開(kāi)發(fā)小肽系列產(chǎn)品，使其富含動(dòng)物生長(zhǎng)必需的有生命活動(dòng)調(diào)節(jié)功能的生物活性肽和易吸收利用的營(yíng)養(yǎng)性短肽。蛋白經(jīng)過(guò)酶解或發(fā)酵處理后具有易于吸收、低抗原等特點(diǎn)，并能加快機(jī)體蛋白合成，提高機(jī)體免疫力，刺激消化道發(fā)育，增進(jìn)動(dòng)物食欲，促進(jìn)礦物元素吸收，加速脂肪代謝等功能，從而提高生長(zhǎng)速度，改善飼料利用率，是新一代綠色、高效、安全的營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑。本試驗(yàn)利用各種蛋白酶水解肝素加工廢水中的腸膜肽，確定最佳酶解條件，以期為該廢水金屬蛋白肽鹽合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料

肝素加工廢水是鹽解法提取肝素鈉工藝廢水，撈取腸膜蛋白后其主要成分分析見(jiàn)表1。

表1 肝素加工廢水主要成分分析

1.1.2 試劑

水解蛋白酶：活力2.4 AU-A/g；風(fēng)味蛋白酶：活力1 000 LAPU/g；復(fù)合蛋白酶：活力1.5AU-NH/g。3種酶及酶活均來(lái)自諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

pHB-5酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠(chǎng)生產(chǎn)）、4℃冷凍離心機(jī)（上海浦東天本離心機(jī)械有限公司生產(chǎn)）、SHT型精密數(shù)顯磁力攪拌電熱套（山東省菏澤市祥龍電子科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解工藝（陸利霞等，2008）

量取一定量肝素廢水，用磷酸鹽緩沖液調(diào)至不同pH值，準(zhǔn)確加入不同量的各種酶（注：相對(duì)于底物粗蛋白含量，下同），在不同溫度下，反應(yīng)一定時(shí)間用酶解液滅酶（100℃，3 min），然后5 000 r/min離心 15 min，取上清液備用測(cè)定水解度。

1.2.2 總氮的測(cè)定

采用凱氏定氮法GB11891——89。

1.2.3 氨基氮的測(cè)定（郭艷，2008；陳貴堂等，2008）

采用甲醛滴定法GB/T5009.39——2003。

1.2.4 水解度的計(jì)算（張全才，2007；陳杰等，2007）

水解度(%)=(氨態(tài)氮/總氮)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù),SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA法進(jìn)行方差分析,S-N-K法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶的確定

從肝素加工廢水中提取易被動(dòng)物吸收的腸膜肽，首先要確定水解酶。催化蛋白質(zhì)水解的酶種類(lèi)很多，主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷形成多肽。外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基的末端逐個(gè)將肽鍵水解，而游離出氨基酸。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的蛋白酶主要是內(nèi)肽酶，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等。水解蛋白時(shí)，內(nèi)肽酶和外肽酶復(fù)合作用才能得到高水解度的復(fù)合氨基酸液。外肽酶還能賦予產(chǎn)生的肽和氨基酸更多的香味和更飽滿(mǎn)的風(fēng)味。

本試驗(yàn)采用水解蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶及水解-風(fēng)味復(fù)合酶。其中風(fēng)味蛋白酶是外切酶，水解蛋白酶是內(nèi)切酶，復(fù)合蛋白酶由內(nèi)切酶和外切酶復(fù)合。根據(jù)各酶適用的水解條件為：pH值7，溫度50 ℃，總酶量 2%，測(cè)定時(shí)間 1、2、3、4、5 h。采取 3 個(gè)平行試驗(yàn)，對(duì)時(shí)間因素選取5個(gè)水平，考察4種蛋白酶水解肝素廢水測(cè)得的水解度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各種蛋白酶水解肝素廢水測(cè)得水解度（%）

由表2可知,以肝素加工廢水為底物，相比之下用風(fēng)味-水解2：1復(fù)合酶水解效果最好。3 h時(shí)蛋白水解度最高,為7.49%。所以選擇風(fēng)味-水解復(fù)合酶做進(jìn)一步研究。

2.2 風(fēng)味-水解復(fù)合酶水解條件的初步確定

影響蛋白酶水解效果的因素有很多，如水解溫度、pH值、水解時(shí)間、料液比、加酶量等。利用單因素試驗(yàn)法設(shè)計(jì)5組試驗(yàn)，分別考察風(fēng)味-水解復(fù)合酶水解的最佳作用條件范圍，對(duì)該酶水解條件進(jìn)行初步確定。

2.2.1 最適反應(yīng)時(shí)間的確定

采取3個(gè)平行試驗(yàn)，pH值為7.0，溫度50℃，加酶量2.0%，風(fēng)味蛋白酶、水解蛋白酶比例為2：1，時(shí)間分別調(diào)至 1、2、3、4、5、6、7、8、9 h，試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

一般來(lái)說(shuō)，同樣的加酶量，水解時(shí)間越長(zhǎng)水解度越高，到了一定的時(shí)間后上升趨勢(shì)會(huì)減慢。由圖1可見(jiàn)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度影響較明顯。在前5 h里隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，蛋白水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，以3 h時(shí)水解度最大。5 h后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸上升?？赡苁莾煞N酶對(duì)該底物的最佳水解時(shí)間差距較大?？紤]能耗因素，故確定最適反應(yīng)時(shí)間為3 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 最適總酶量的確定

采取3個(gè)平行試驗(yàn)，水解pH值為7.0、溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間為3 h、風(fēng)味蛋白酶、水解蛋白酶比例為2：1，改變反應(yīng)體系中的酶添加量（1%、2%、3%、4%），考察酶添加量與腸膜蛋白提取率的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶與水解蛋白酶以2：1比例復(fù)合時(shí)，總濃度在2%其水解度最大，所以確定兩種酶總濃度最適為2%。

2.2.3 風(fēng)味蛋白酶與水解蛋白酶最適比的確定

采取3個(gè)平行試驗(yàn)，水解pH值為7.0，溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h，加酶總量為2%，風(fēng)味、水解蛋白酶比例分別為 1： 1、2： 1、3： 1、4： 1，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，酶總量為2%時(shí)水解度隨風(fēng)味蛋白酶與水解蛋白酶復(fù)合比例的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，兩酶以2：1復(fù)合時(shí)腸膜蛋白水解度最大，但總體上兩酶的比例對(duì)蛋白水解度影響不大。故確定風(fēng)味蛋白酶與水解蛋白酶最適比為2：1。

2.2.4 最適酶解溫度的確定

采取3個(gè)平行試驗(yàn)，水解pH值為7.0，反應(yīng)時(shí)間為3 h，加酶總量為2%，風(fēng)味、水解蛋白酶比例為2：1，酶解溫度分別設(shè)為40、50、60、70℃，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

酶對(duì)溫度也比較敏感，有其最適的反應(yīng)溫度范圍。由圖4可知，隨著溫度的增加，水解度總體呈上升趨勢(shì)，40℃至50℃上升較明顯，50℃之后比較平緩，考慮經(jīng)濟(jì)因素，確定最適反應(yīng)溫度為50℃。

2.2.5 最適pH值的確定

采取3個(gè)平行試驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間為3 h，加酶總量為2%，風(fēng)味、水解蛋白酶比例為2：1，酶解溫度為50 ℃，pH 值設(shè)為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，試驗(yàn)中每隔半小時(shí)對(duì)pH值進(jìn)行一次調(diào)節(jié),試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

酶作為一種具有生物活性的蛋白質(zhì)，環(huán)境pH值會(huì)影響酶分子的構(gòu)象和酶分子及底物的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和酶促反應(yīng)速度。由圖5可知，pH值對(duì)該酶水解效果影響較明顯。隨著pH值的增加，水解度呈下降的趨勢(shì)，在pH值為4.0到7.0之間較平緩，而7.0之后下降幅度較大。所以選擇pH值為4.0、5.0、6.0 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 風(fēng)味-水解復(fù)合酶酶解正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)初步確定的酶解條件，選擇pH值，酶總濃度，風(fēng)味、水解蛋白酶比例，反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度作為試驗(yàn)因素，以水解度為指標(biāo)，采用L16（35）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)風(fēng)味蛋白酶與水解蛋白酶酶解肝素廢水條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 L16（35）正交試驗(yàn)因素水平

表4 風(fēng)味-水解蛋白酶水解肝素廢水正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 L16（35）正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

從極差分析正交試驗(yàn)的方差分析（表5）可以看出，五因素對(duì)水解度的影響程度不同，影響的主次順序也不盡相同。其中酶總濃度和風(fēng)味蛋白酶與水解蛋白酶量之比對(duì)水解度影響較大。各因素影響程度由大到小順序?yàn)?C（風(fēng)味、水解蛋白酶比例）＞B（酶總濃度）＞D（時(shí)間）＞A（pH 值）＞E（溫度），最佳試驗(yàn)條件為 A2B3C1D1E1。根據(jù) Ki分析的最佳組合為A1B3C3D3E1，用A1B3C3D3E1組合進(jìn)一步試驗(yàn)，得腸膜肽水解度為16.18%。所以，風(fēng)味蛋白酶與水解蛋白酶酶解肝素廢水最佳組合為 A2B3C1D1E1，即酶總濃度3%，風(fēng)味、水解蛋白酶比例為1：1，酶解溫度50℃，pH值5.0，酶解時(shí)間2 h，此條件下的水解度為17.45%。

關(guān)于腸膜蛋白的提取，舒夏娃等（2007）選用木瓜蛋白酶對(duì)豬小腸黏膜提取肝素后的下腳料進(jìn)行水解，結(jié)果表明，影響水解度的主次因素順序?yàn)椋簻囟龋镜孜餄舛龋久讣恿浚緋H值，最佳的水解條件下的水解度為20.63%，此時(shí)底物濃度為6%。本試驗(yàn)得到的蛋白水解度偏低可能是由于底物濃度較低，而且由于原料性質(zhì)的限制，未對(duì)底物濃度對(duì)酶解的效果進(jìn)行考察。王春維等（2005）通過(guò)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)豬腸膜水解效果研究表明,木瓜蛋白酶優(yōu)于胰蛋白酶,影響木瓜蛋白酶水解度的主次因素順序?yàn)椋簳r(shí)間＞溫度＞pH值，最適條件下的蛋白水解度為83.45%。可見(jiàn)，蛋白水解度與底物的濃度，蛋白的含量有很大關(guān)系。

3 結(jié)論

確定風(fēng)味-水解蛋白酶為最適水解酶。采用單因素及正交試驗(yàn)方法確定風(fēng)味蛋白酶與水解蛋白酶復(fù)合酶酶解肝素廢水的最適條件，即酶總濃度3%，風(fēng)味、水解蛋白酶比例為1：1，酶解溫度 50℃，pH值5.0，酶解時(shí)間2 h。在此條件下水解度為17.45%。

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