劉淮德 劉 梅 王寶杰 蔣克勇 張國(guó)范 王 雷

中國(guó)明對(duì)蝦主要分布在我國(guó)黃渤海和朝鮮西部沿海，南海部分海域也有少量存在，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖對(duì)蝦之一。中國(guó)明對(duì)蝦是中國(guó)的特產(chǎn)，也是重要的出口水產(chǎn)品，無論是品質(zhì)還是市場(chǎng)價(jià)格都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他養(yǎng)殖對(duì)蝦品種，其最高養(yǎng)殖年產(chǎn)量曾達(dá)到近20萬噸。而隨其養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，對(duì)蝦疾病的發(fā)生越來越頻繁，1993年爆發(fā)的病毒性流行病，使中國(guó)明對(duì)蝦的養(yǎng)殖遭受毀滅性打擊，此后始終未能全面恢復(fù)。近年來，隨著生態(tài)養(yǎng)殖和健康養(yǎng)殖的發(fā)展，一些微生態(tài)制劑開始應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，以改善養(yǎng)殖環(huán)境，減少病害和提高免疫力。目前有關(guān)微生物制劑的研究與開發(fā)在國(guó)內(nèi)外均得到很大的重視，市場(chǎng)上已有大量用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的專用產(chǎn)品銷售。水產(chǎn)微生態(tài)制劑是以后水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治的發(fā)展方向，但其被水產(chǎn)動(dòng)物口服后的作用機(jī)理并不十分清楚。了解對(duì)蝦腸道微生物區(qū)系微生物的組成、結(jié)構(gòu)及其生理功能如何，在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步研究外源有益微生物制劑對(duì)其影響，將有助于微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的有效應(yīng)用與推廣。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和分子生物學(xué)技術(shù)的成熟，利用分子生物學(xué)手段研究腸道微生物組成日益成為熱點(diǎn)。水產(chǎn)動(dòng)物的腸道內(nèi)存在著大量的微生物，腸道微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)平衡是動(dòng)物保持健康和正常生長(zhǎng)所必需的條件，腸道內(nèi)有益微生物群對(duì)宿主起著屏障、營(yíng)養(yǎng)和免疫等作用。本文采用不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)手段16S rRNA基因克隆文庫(kù)法，分析中國(guó)明對(duì)蝦腸道群落組成，以期為水產(chǎn)微生態(tài)制劑的使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集與處理

海捕中國(guó)明對(duì)蝦，于2008年夏天購(gòu)自青島小港水產(chǎn)品市場(chǎng)，為健康對(duì)蝦成體，雄性，平均體長(zhǎng)為12 cm，購(gòu)回的活體蓄養(yǎng)空腹后于超凈臺(tái)內(nèi)用70%乙醇進(jìn)行體表消毒后，無菌條件下解剖取出腸道。

1.1.2 主要試劑和儀器

PCR 儀（PTC-100），GelDoc凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

DNA純化試劑盒購(gòu)自上海生工，質(zhì)粒pMD18-T，限制性內(nèi)切酶（MspI和HhaI）購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 腸道微生物總DNA的提取

取200 mg腸道樣品，液氮研磨，加入l ml PBS(pH 值 7.4，0.1 mol/l磷酸鈉緩沖液) 和 20 μl 20%PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)，充分均質(zhì)化后200×g離心6 min，取上清；沉淀中再加人1 ml PBS，離心，取上清；合并兩次上清，再次300×g離心6 min，取上清；再以12 000×g離心6 min收集菌體，并用PBS洗滌。在得到的菌體中加入300 μl裂解液I(150 mM NaCl，100 mM EDTA·Na2，pH 值 8.0)、10%溶菌酶 100 μl和1%RNaseA 20 μl，混勻后37℃保溫 30 min。加入300 μl裂解液 II(100 mM NaC1，500 mM Tris-HCl，pH 值 8.0)及50 μl 20%SDS（十二烷基磺酸鈉）和 50 μl 20%PVPP，混勻后冰浴5 min。加入等體積Tris飽和酚：氯仿：異戊醇為25：24：1溶液，13 000×g離心8 min，取上清；再加入等體積氯仿：異戊醇(24：1)，13 000×g離心 8 min，取上清(重復(fù)操作 1 次)。加入1/10體積3 M醋酸鈉及兩倍體積乙醇，－20℃沉淀2 h以上。15 000×g離心15 min，70%乙醇洗滌1次，超凈臺(tái)下干燥沉淀。沉淀用40 μl TE(100 mmol/l Tris-HCl,1 mmol/l EDTA,pH值8.0)溶解，－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

PCR 引物：27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTC-3';M=A 或 C）；1387R（5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3';W=A或T）。

PCR 體系：無菌雙蒸水 34.5 μl，10×PCR 緩沖液5 μl，2.5 mmol/l dNTP 4 μl，2.5 μmol/l PCR 引物各 2 μl，Taq 酶 0.5 μl，模板 DNA 2 μl。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，切下條帶，用上海生工膠回收試劑盒回收。

1.4 16S rDNA克隆轉(zhuǎn)化和文庫(kù)構(gòu)建

按照pMD18-T載體試劑盒說明，將純化后的產(chǎn)物與載體pMD18-T連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli Top10中。

1.5 陽性克隆子的RFLP分析

用菌落PCR方法驗(yàn)證16S rRNA基因文庫(kù)中的陽性克隆。選擇通用引物T7和SP6擴(kuò)增pMD18-T載體多克隆位點(diǎn)之間的序列，擴(kuò)增條件同上。擴(kuò)增產(chǎn)物用4堿基限制性內(nèi)切酶MspI和HhaI進(jìn)行酶切消化(37℃過夜)，酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.6 DNA測(cè)序和分析

挑取代表性克隆，送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，計(jì)算文庫(kù)的覆蓋率。測(cè)定的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST程序進(jìn)行相似性搜索，從中選擇相近的典型菌株16S rRNA序列，用Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果和分析

2.1 總DNA的抽提

腸道微生物基因組總DNA提取電泳圖見圖1?？侱NA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，在大于10 kb處出現(xiàn)條帶。

2.2 16S rDNA片段的擴(kuò)增

總DNA的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均獲得了特異性擴(kuò)增片段。從圖2中可以看出，片段大小在1 500 bp左右，且沒有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象,得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物適合下一步16S rDNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建。

2.3 16S rDNA基因克隆文庫(kù)分析

從文庫(kù)中挑選60個(gè)白色菌落，菌落PCR檢測(cè)到陽性克隆為55個(gè)。根據(jù)樣品酶切片段大小和數(shù)量區(qū)別電泳條帶譜型，結(jié)果表明，在中國(guó)明對(duì)蝦腸道16S rDNA文庫(kù)55個(gè)陽性克隆共有13種細(xì)菌RFLP譜型。

以覆蓋率(C)來評(píng)估所構(gòu)建的文庫(kù)對(duì)環(huán)境微生物多樣性的體現(xiàn)，計(jì)算公式為：

式中，N代表所分析的克隆數(shù)，n1代表具有不重復(fù)序列的克隆數(shù) (16S rDNA序列＞97%為重復(fù)序列)。計(jì)算結(jié)果表明，所構(gòu)建的16S rDNA克隆文庫(kù)覆蓋率達(dá)到76.36%，即包含了對(duì)蝦腸道中76.36%的細(xì)菌多樣性狀況。因此，從覆蓋率分析可以說明所構(gòu)建的16S rDNA克隆文庫(kù)能夠較完整地反映所屬環(huán)境中的細(xì)菌多樣性狀況。

2.4 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

挑選具有代表性的克隆子測(cè)序，去除載體序列部分，將所得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，搜索相關(guān)序列，比對(duì)結(jié)果如表1所示。55個(gè)陽性克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知16S rDNA序列相似性最高為99%，最低為87%；其中31個(gè)克隆子與已知序列相似性高于98%，其余克隆子(24個(gè)，占43.6%)與已知序列同源性低于94%。測(cè)序55克隆，弧菌22克隆，占40.0%，柔膜細(xì)菌11克隆，占20.0%，光合細(xì)菌3克隆，占54.5%，不可培養(yǎng)細(xì)菌19克隆，占34.5%。結(jié)果顯示中國(guó)明對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為弧菌，其次為不可培養(yǎng)細(xì)菌和柔膜細(xì)菌。

表1 部分中國(guó)明對(duì)蝦腸道微生物DNA文庫(kù)比對(duì)結(jié)果

3 討論

對(duì)蝦腸道微生物的早期研究主要是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，而近年來分子方法開始被大多數(shù)人采用。普遍認(rèn)為水生無脊椎動(dòng)物腸道微生物的組成為弧菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬和氣單胞菌屬。Yasuda等（1980）發(fā)現(xiàn)幼蝦中，弧菌屬占優(yōu)勢(shì)，而成年蝦中，假單胞菌屬占優(yōu)勢(shì)；Dempsey等（1989）發(fā)現(xiàn)，弧菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬和假單胞菌屬為蝦腸道優(yōu)勢(shì)種群；王祥紅等（2000）發(fā)現(xiàn)，弧菌屬和發(fā)光桿菌屬在野生中國(guó)明對(duì)蝦腸道中為優(yōu)勢(shì)菌屬。Moss等（2000）發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬。Oxley等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，野生和養(yǎng)殖對(duì)蝦有相似的腸道微生物組成，包括氣單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬。Esiobu發(fā)現(xiàn)，健康的桃紅對(duì)蝦腸道中優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬。這些研究都是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，然后鑒定得到優(yōu)勢(shì)種群。李志勇等（2005）發(fā)現(xiàn)，不同對(duì)蝦及同一種對(duì)蝦的鰓部與腸道內(nèi)的細(xì)菌組成差異性非常大；而羅鵬等（2006）經(jīng)比較研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)不同環(huán)境的優(yōu)勢(shì)種群十分明顯。兩者采用的都是PCR-DGGE方法，但僅僅比較了不同對(duì)蝦之間的腸道微生物組成差異，并沒有比較分析對(duì)蝦腸道微生物中各種群之間的關(guān)系。本研究采用16S rDNA基因文庫(kù)法分析中國(guó)明對(duì)蝦腸道微生物區(qū)系組成，結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，采用分子生物學(xué)方法得到一些不可培養(yǎng)細(xì)菌的信息，更貼近真實(shí)情況，但是由于所選陽性克隆數(shù)較少，文庫(kù)的覆蓋率為76.36%，如果能再增加陽性克隆數(shù)目，就能更加完整地反映腸道微生物區(qū)系的真實(shí)組成。

16S rRNA基因克隆文庫(kù)技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)廣泛地用于各種生態(tài)系統(tǒng)微生物組成的多樣性研究中，例如人們?cè)趯?duì)廢水處理系統(tǒng)、土壤、海洋、人體胃腸道系統(tǒng)等生態(tài)系統(tǒng)中的微生物進(jìn)行研究時(shí)都用到該技術(shù)。目前，基于16S rRNA基因克隆文庫(kù)的分析方法是用于調(diào)查一個(gè)環(huán)境樣品中微生物組成情況的常用方法。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，應(yīng)用克隆文庫(kù)技術(shù)可建立一種不依傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)而能原位揭示對(duì)蝦體內(nèi)細(xì)菌種群組成的分子診斷技術(shù)和病原菌分子診斷技術(shù)。通過檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物腸道正常微生物區(qū)系組成，建立基于機(jī)體內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的健康水產(chǎn)動(dòng)物評(píng)價(jià)技術(shù)。還可檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物的動(dòng)態(tài)變化和病害后微生物區(qū)系組成的差異，以及使用微生態(tài)制劑前后微生物區(qū)系組成的差異，為水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。通過對(duì)蝦腸道內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的揭示將為新的水產(chǎn)微生物制劑菌株的開發(fā)和應(yīng)用提供候選菌株和理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文采用不依賴于培養(yǎng)的分子生物學(xué)手段16S rRNA克隆文庫(kù)法分析中國(guó)明對(duì)蝦腸道微生物群落組成。從中國(guó)明對(duì)蝦腸道中提取微生物基因組DNA，以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F/1387R擴(kuò)增16S rRNA基因序列，構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)。結(jié)果表明，中國(guó)明對(duì)蝦腸道微生物主要由弧菌、光合細(xì)菌、不可培養(yǎng)細(xì)菌組成，弧菌為優(yōu)勢(shì)菌。16S rRNA克隆文庫(kù)法能夠反映對(duì)蝦腸道微生物中種群的組成關(guān)系，是研究水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物區(qū)系組成的可行方法。

17篇，刊略，需者可函索）