薛慶於,韓 野,郭聯(lián)和,王 俊,于智勇,王君,沈維干

(1.揚州職業(yè)大學生化工程系,江蘇揚州,225000;2.揚州大學醫(yī)學院,江蘇 揚州,225001)

泛素系統(tǒng)和其對蛋白質(zhì)翻譯后的修飾作用的影響是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號通路。與泛素化修飾引起靶蛋白降解不同,真核細胞中存在一種小的類泛素修飾因子-1(SUMO-1),其對蛋白質(zhì)的修飾作用是調(diào)節(jié)細胞中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用和轉(zhuǎn)錄活性、增強底物的穩(wěn)定性或影響靶蛋白亞細胞定位[1-3]?；蛐酒芯拷Y(jié)果顯示,缺氧培養(yǎng)的細胞中SUMO-1 mRNA的表達表現(xiàn)為時間依賴性的增加[4]。缺氧應(yīng)激研究發(fā)現(xiàn),許多SUMO-1的底物與轉(zhuǎn)錄或者翻譯后的調(diào)節(jié)相關(guān),這些底物包括 p53、Mdm2、c-jun、Glut-1和Glut-4等,提示SUMO-1在缺氧應(yīng)答中扮演重要角色[4-5]。

細胞對低氧應(yīng)激的直接反應(yīng)之一是在細胞內(nèi)積聚缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亞單位組成的異二聚體。在正常氧供應(yīng)的環(huán)境中,HIF-1α通過泛素化/蛋白酶體途徑降解;在缺氧時,HIF-1α與HIF-1β形成穩(wěn)定異二聚體轉(zhuǎn)移到細胞核中,與許多基因(如VEGF、纖溶酶原活化蛋白抑制基因等)的啟動子或增強子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合,從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)與血管生成、糖代謝等過程相關(guān)的基因的表達,表現(xiàn)為多方位、多途徑的調(diào)節(jié)作用[6]。

盡管類泛素化修飾作用的生物化學和酶學已經(jīng)被揭示,但是絕大多數(shù)的報道僅集中在SUMO-1如何識別和與靶蛋白相互作用,有關(guān)SUMO-1表達的調(diào)節(jié)和其功能的實施在體內(nèi)外仍然了解很少,特別是對于SUMO-1在低氧或缺氧環(huán)境下與HIF-1以及由HIF-1引起的下游信號通路的作用尚無確切的報道。本研究主要研究SUMO-1在低氧應(yīng)激過程中對HIF-1α表達以及對依賴于HIF-1的基因轉(zhuǎn)錄激活的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL-VEGF/K(含有VEGF啟動子全長序列的表達熒光素酶的報告質(zhì)粒)、pGL-VEGF/P(缺乏HRE的表達熒光素酶的報告質(zhì)粒)、pGL-HREmut(含有突變位點的HRE的表達熒光素酶的報告質(zhì)粒)和pGL-HRE(僅含有HRE的表達熒光素酶的報告質(zhì)粒)由美國NIH的Gutkind教授惠贈[7]。pcDNA3.1-SUMO-1、pEGFP-C3 、β-半乳糖苷酶報告質(zhì)粒(β-gal)和HEK293細胞為本實驗室保存。膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司,小牛血清購自杭州四季清生物工程材料有限公司,DMEM購自Gibico公司,鼠抗人HIF-1α和 α-tubulin單克隆抗體和兔抗鼠IgG抗體購自Santa cruz公司,限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III和T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司,低氧培養(yǎng)盒購自中國長沙長錦科技有限公司;低氧混合氣(1%O2、5%CO2和平衡N2)購自南京特種氣體廠。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建pEGFP-C3-SUMO-1真核表達質(zhì)粒按照文獻報道的方式[8],用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-SUMO-1,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、DNA膠純化試劑盒純化目的基因片段,獲得人SUMO-1目的基因,并亞克隆到表達載體pEGFP-C3的相應(yīng)酶切位點中得到pEGFP-C3-SUMO-1真核表達質(zhì)粒。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細胞系的篩選:HEK293細胞接種到6孔板中,培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 mg/L青霉素和1 000 U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃,含5%CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,按照說明書操作分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C3和pEGFP-C3-SUMO-1到培養(yǎng)的相應(yīng)的HEK293細胞中,培養(yǎng)48 h后通過G418抗性法篩選穩(wěn)定表達GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細胞系,G418濃度為300 mg/L。用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 免疫印跡檢測:對數(shù)生長期的HEK293細胞、穩(wěn)定表達 GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細胞,常氧和低氧培養(yǎng)24 h后,分別用預(yù)冷的PBS洗2次,吸干所有液體,加細胞裂解緩沖液(臨用前補加2 mmol/L PMSF和 cocktail),冰浴30 min后,1 2000 g離心10 min,取上清。采用Bradford法進行蛋白定量,加入樣品緩沖液,99℃處理 5 min,加樣到 8%SDS PAGE,按常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至PVDF膜,隨后用含3%BSA的PBS進行封閉1 h,與一抗孵育,4℃過夜,分別用PBS-Tween 20洗膜3次,每次10 min,用堿性磷酸酶結(jié)合的二抗室溫孵育2 h,用含有NBT和BCIP的堿性磷酸酶緩沖液顯色。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 熒光素酶報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和檢測:細胞瞬時轉(zhuǎn)染采用常規(guī)磷酸鈣沉淀方法,分別用相應(yīng)的報告質(zhì)粒pGL-VEGF/K、pGL-VEGF/P、pGLHREmut或 pGL-HRE(每孔 1.5 μ g)與 β-gal(作為內(nèi)標,每孔0.5 μ g)共轉(zhuǎn)染HEK293細胞、穩(wěn)定表達GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細胞,過夜培養(yǎng)后用PBS洗細胞2次,更換培養(yǎng)液,分別在常氧和低氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。低氧培養(yǎng)時,將細胞置于密封的低氧培養(yǎng)盒中,用低氧混合氣平衡10 min(1 L/min),然后轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用Promega公司提供的試劑盒,按照說明書操作,檢測細胞裂解液中熒光素酶的活性;用鄰-硝基苯-β-D半乳糖苷(ONPG)為底物,檢測β-半乳糖苷酶活性作為對照(轉(zhuǎn)染效率),計算熒光素酶的活性,并與對照組相比,計算并比較變化的倍數(shù),每組設(shè)3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計學處理:采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件的One-way ANOVA程序進行單因素方差分析,進行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以(±s)表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SUMO-1與GFP融合基因在HEK293細胞中的表達

pEGFP-C3和pEGFP-C3-SUMO-1轉(zhuǎn)染HEK293細胞,經(jīng)G418篩選后的建立穩(wěn)定表達細胞系,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFPC3的細胞中GFP分布于整個細胞,而轉(zhuǎn)染pEGFP-SUMO-1的細胞中融合蛋白的表達集中于細胞核中(圖1)。

圖1 SUMO-1基因在HEK293細胞中的表達 (200倍)

2.2 低氧可以上調(diào)SUMO-1的表達

對數(shù)生長期的HEK293細胞,經(jīng)常氧和低氧培養(yǎng)24 h后,免疫印跡結(jié)果由圖2可見,與常氧培養(yǎng)相比,低氧可以上調(diào)HEK293細胞中SUMO-1蛋白的表達。

圖2 Western blot檢測HEK293細胞中SUMO-1的表達

2.3 SUMO-1可以上調(diào)HIF-1α的表達

HEK293細胞、穩(wěn)定表達 GFP和 GFPSUMO-1的HEK293細胞,在低氧培養(yǎng)盒中培養(yǎng)24 h后,裂解細胞,經(jīng)定量分析后的細胞裂解液與SDS-PAGE上樣緩沖液混勻處理后,電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合并檢測。實驗結(jié)果由圖3可見,穩(wěn)定表達SUMO-1的HEK293細胞中的HIF-1α的表達量與未轉(zhuǎn)染(空白對照組)和轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的HEK293細胞中的表達量相比顯著提高。

2.4 SUMO-1可以上調(diào)HEK293細胞中HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性

應(yīng)用一系列的 VEGF-Luc報告質(zhì)粒(pGLVEGF/K 、pGL-VEGF/P 、pGL-HREmut和 pGLHRE)分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞、穩(wěn)定表達GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細胞,并進行低氧和常氧培養(yǎng)24 h后的實驗結(jié)果由圖4可見,在常氧和低氧培養(yǎng)時,穩(wěn)定表達SUMO-1的HEK293細胞(C)組與空白對照組(未轉(zhuǎn)染的細胞,A)和穩(wěn)定表達GFP的細胞(轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的細胞,B)相比,pGL-VEGF/K和pGL-HRE轉(zhuǎn)染后表達的熒光素酶報告基因活性明顯增高,而A、B組細胞無論常氧培養(yǎng)還是低氧培養(yǎng),兩組之間相比均無顯著性差異。穩(wěn)定表達SUMO-1的細胞(C)在pGL-VEGF/P和pGL-HREmut轉(zhuǎn)染的細胞中熒光素酶報告基因活性,無論在常氧培養(yǎng)還是低氧培養(yǎng)時,與空白對照組(A)和穩(wěn)定表達GFP的細胞組(C)相比均無顯著性差異。

圖3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞的HIF-1α的表達

圖4 SUMO-1對依賴于HIF-1的熒光素酶報告基因表達的影響

3 討 論

缺氧與許多生理和病理過程密切相關(guān)。腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程依賴于血管新生,依靠新生血管來提供營養(yǎng)(包括氧氣)和排泄廢物。在缺乏新生血管的情況下,腫瘤通常在長到幾毫米后由于缺氧而停止生長[9]。細胞對低氧應(yīng)激的直接反應(yīng)之一是在細胞內(nèi)積聚轉(zhuǎn)錄因子HIF-1,在細胞對環(huán)境條件的應(yīng)答調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4,9]。低氧應(yīng)激的小鼠的腦組織和心臟組織中SUMO-1的表達上調(diào),而這種上調(diào)可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)HIF-1α的功能[10]。HIF-1參與細胞內(nèi)的多種生物學過程,包括血管生成、能量代謝以及細胞存活等。HIF-1有對氧氣敏感的HIF-1α以及對氧氣不敏感的HIF-1β組成,而 HIF-1α需經(jīng)歷翻譯后的修飾,如羥基化修飾、泛素化修飾、乙?；揎梺碚{(diào)節(jié)其穩(wěn)定性。由SUMO-1介導(dǎo)的HIF-1α的翻譯后的修飾,可以穩(wěn)定HIF-1α的穩(wěn)定性,但是對其轉(zhuǎn)錄活性的影響的報道結(jié)果不一,有研究認為HIF-1α的翻譯后的SUMO修飾并不影響HIF-1α的降解,HIF-1α與 SUMO共價結(jié)合,會導(dǎo)致HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性下降[11],而另外的研究則認為SUMO-1對HIF-1α的翻譯后修飾,可以穩(wěn)定并上調(diào)的表達,增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性[12]。

本研究首先應(yīng)用表達SUMO-1與GFP融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞,并篩選穩(wěn)定表達的細胞系,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的細胞中 GFP分布于整個細胞,而轉(zhuǎn)染pEGFP-SUMO-1的細胞中融合蛋白的表達集中于細胞核中,明確了SUMO-1的核定位。通過低氧處理HERK293細胞,結(jié)果顯示,低氧可以上調(diào)細胞中SUMO-1蛋白的表達,這與文獻報道的結(jié)果是一致的[4,10]。利用篩選和建立的穩(wěn)定表達SUMO-1細胞系,通過低氧培養(yǎng),結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達SUMO-1的HEK293細胞中的HIF-1α的表達量與空白對照組以及穩(wěn)定表達EGFP的細胞中的表達量相比顯著提高,說明在低氧應(yīng)激過程中SUMO-1可以穩(wěn)定或者上調(diào)HIF-1α。

為了證明在低氧應(yīng)激過程中,SUMO-1穩(wěn)定或者上調(diào)HIF-1α,是否會影響HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性,本研究應(yīng)用一系列含有VEGF啟動子的不同缺失突變體的 VEGF-Luc報告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞、穩(wěn)定表達GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細胞,并進行低氧和常氧培養(yǎng),實驗結(jié)果表明,在常氧和低氧培養(yǎng)時,轉(zhuǎn)染含有VEGF啟動子全長序列的報告質(zhì)粒(pGL-VEGF/K)和僅含有完整HRE的報告質(zhì)粒(pGL-HRE)的穩(wěn)定表達SUMO-1的HEK293細胞中的熒光素酶報告基因的表達與空白對照組以及穩(wěn)定表達GFP的細胞中相比明顯增高,尤以低氧培養(yǎng)時更加顯著;而轉(zhuǎn)染缺乏HRE的VEGF啟動子序列的報告質(zhì)粒(pGL-VEGF/P)和含有HRE突變位點的報告質(zhì)粒(pGL-HREmut)的穩(wěn)定表達SUMO-1的細胞中的熒光素酶報告基因的表達無論在常氧培養(yǎng)還是低氧培養(yǎng)時,與對照組相比均無顯著差異。這些結(jié)果說明,在低氧應(yīng)激培養(yǎng)條件下,SUMO-1可以明顯上調(diào)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性,而且這種轉(zhuǎn)錄上調(diào)的機制是通過促進HIF-1與HRE序列的結(jié)合。

盡管SUMO-1修飾作用的生物化學和酶學已經(jīng)被揭示[13],但是絕大多數(shù)的報道僅集中在SUMO-1如何識別和與靶蛋白相互作用,有關(guān)SUMO-1表達的調(diào)節(jié)和其功能的實施在體內(nèi)外仍然了解很少,特別是對于SUMO-1在低氧或缺氧環(huán)境下與HIF-1以及由HIF-1引起的下游信號通路的作用尚無確切的報道。本實驗結(jié)果表明,低氧可以上調(diào)SUMO-1的表達,SUMO-1過表達可以上調(diào)HIF-1α表達,當然這種上調(diào)是是否是通過直接抑制HIF-1α的泛素化降解來實現(xiàn)的,還有待于進一步研究,但是本研究結(jié)果進一步明確SUMO-1可以通過促進HIF-1與HRE序列的結(jié)合而上調(diào)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。

[1]Matunis MJ,Coutavas E,Blobel G.A novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning of the Ran-GTPaseactivating protein RanGAP1 between the cytosol and the nuclear pore complex[J].J Cell Biol,1996,135(6 Pt 1):1457.

[2]Desterro JM,Rodriguez MS,Hay RT.SUMO-1 modification of IkappaBalpha inhibits NF-kappaB activation[J].Mol Cell,1998,2(2):233.

[3]Kang SI,Chang WJ,Cho SG,et al.Modification of promyelocytic leukemia zinc finger protein(PLZF)by SUMO-1 conjugation regulates its transcriptional repressor activity[J].J Biol Chem,2003,278(51):51479.

[4]Comerford KM,Leonard MO,Karhausen J,et al.Small ubiquitin-related modifier-1 modification mediates resolution of CREB-dependent responses to hypoxia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(3):986.

[5]Blagosklonny MV.Do VHL and HIF-1 mirror p53 and Mdm-2?Degradation-transactivation loops of oncoproteins and tumor suppressors[J].Oncogene,2001,20(3):395.

[6]Huang LE,Bunn HF.Hypoxia-inducible factor and its biomedical relevance[J].J Biol Chem,2003,278(22):19575.

[7]Sodhi A,Montaner S,Miyzaki H,et al.MAPK and Akt act cooperatively but independently on hypoxia inducible factor-1alpha in rasV12 upregulation of VEGF[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,287(1):292.

[8]徐軍發(fā),袁春雷,楊衡,等.小鼠B7-H4基因克隆及真核表達載體的構(gòu)建[J].細胞與分子免疫學雜志,2007,23:665.

[9]Harris AL.Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):38.

[10]Shao R,Zhang FP,Tian F,et al.Increase of SUMO-1 expression in response to hypoxia:direct interaction with HIF-1alpha in adult mouse brain and heart in vivo[J].FEBS Lett,2004,569(1-3):293.

[11]Berta MA,Mazure N,Hattab M,et al.SUMOylation of hypoxia-inducible factor-1alpha reduces its transcriptional activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,360(3):646.

[12]Bae SH,Jeong JW,Park JA,et al.Sumoylation increases HIF-1alpha stability and its transcriptional activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,324(1):394.

[13]Carbia-Nagashima A,Gerez J,Perez-Castro C,et al.RSUME,a small RWD-containing protein,enhances SUMO conjugation and stabilizes HIF-1alpha during hypoxia[J].Cell,2007,131(2):309.