龔春香,王長(zhǎng)榮,龔衛(wèi)娟,胡茂志,季明春

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,江蘇揚(yáng)州,225001;2.金壇市人民醫(yī)院,江蘇金壇,213200;3.揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心,江蘇揚(yáng)州,225001)

NK細(xì)胞被稱為大顆粒淋巴細(xì)胞,是體內(nèi)抗腫瘤、抗病毒感染的第一道防線。其胞漿內(nèi)含有高濃度以囊泡形式存在的細(xì)胞毒性顆粒,如穿孔素、顆粒酶等[1]。溶酶體相關(guān)膜蛋白-1(LAMP-1或CD107a)是一種高糖基化的蛋白,約占溶酶體膜蛋白的50%[2-3]。NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí),毒性顆粒將到達(dá)漿膜面并與細(xì)胞膜融合,引起顆粒內(nèi)容物釋放,最終導(dǎo)致靶細(xì)胞的死亡[4]。隨著脫顆粒的發(fā)生,CD107a分子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面,且CD107a分子的表達(dá)上調(diào)與穿孔素的分泌一致[5]。因此,CD107a分子陽(yáng)性表達(dá)的NK細(xì)胞可代表具有殺傷活性的NK細(xì)胞。

長(zhǎng)期以來,51Cr釋放實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞毒活性的金標(biāo)準(zhǔn),但51Cr具有半衰期短和放射性等缺點(diǎn)[6]。國(guó)內(nèi)大多采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法,但表現(xiàn)出敏感性低的缺點(diǎn)[7],從而期待發(fā)展敏感、特異、安全、簡(jiǎn)單、快捷的檢測(cè)細(xì)胞毒活性方法。本課題組曾建立穩(wěn)定表達(dá)EGFP的K562細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞與其作用后標(biāo)記碘化丙啶(PI),計(jì)算PI和EGFP雙陽(yáng)性細(xì)胞占總EGFP細(xì)胞的比例,作為一種評(píng)估NK細(xì)胞毒活性的方法[8]。在此我們利用CD107a分子反映NK細(xì)胞脫顆粒的特點(diǎn),標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞,建立基于CD107a標(biāo)記流式細(xì)胞儀分析NK細(xì)胞毒性的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Axis-shield。熒光抗體CD56-FITC(MEM188),CD107a-PECy5(eBioH4A3)購(gòu)自 eBioscience公司。佛波脂醇(PMA)、離子霉素購(gòu)自Sigma。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自invitrogen公司,胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。LDH法檢測(cè)試劑盒CytoTox96 non-radioactive cytotoxicity assay購(gòu)于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):K562是高度未分化,不表達(dá)MHCⅠ類分子的人紅白血病細(xì)胞。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸細(xì)胞,37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.2.2 人PBMCs的分離:健康志愿者外周血用PBS緩沖液作等倍稀釋后,將細(xì)胞懸液與Ficoll分離液按體積比2∶1沿管壁緩慢加入至Ficoll分離液面上,室溫 2 000 rpm,15 min,緩慢增速,無制動(dòng)停轉(zhuǎn)。吸取中間白霧狀細(xì)胞層,PBS緩沖液洗滌2遍,用RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮,顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀(FCM)分析NK細(xì)胞CD107a表達(dá):用RPMI 1640完全培養(yǎng)基懸PBMCs,調(diào)整濃度為1×106/mL,K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞。將PBMCs與K562以一定比例混合,置于U型孔,37℃CO2培養(yǎng)箱孵育2 h,加莫能菌素(monensin,2 μ mol/L)繼續(xù)孵育 3.5 h后加 PE-Cy5-CD107a、FITC-CD56抗體孵育半 h。PBS 緩沖液洗滌3次后,用200 μ L 1%多聚甲醛固定進(jìn)行流式分析。PBMCs同時(shí)僅用佛波脂醇(PMA,2.5 μ g/mL)和離子霉素(Ionomycin,0.5 μ g/mL)刺激為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 LDH釋放法分析NK細(xì)胞殺傷毒性:將不同稀釋度的PBMCs與對(duì)數(shù)期K562細(xì)胞按1:3、1:1、3:1的效靶比例混合,250 g離心4 min,37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h,收集上清,加入底物作用 30 min后,再加入終止液檢測(cè)各孔490 nm時(shí)的吸光度值。同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞的自然釋放孔、最大釋放孔、培養(yǎng)基對(duì)照孔、體系效正孔、效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔,每組細(xì)胞設(shè)4復(fù)孔。殺傷百分率=(實(shí)驗(yàn)組-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放-靶細(xì)胞自然釋放)/(靶細(xì)胞最大釋放-靶細(xì)胞自然釋放)×100。

2 結(jié) 果

2.1 FCM 分析CD56和CD107a雙陽(yáng)性細(xì)胞

外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)與K562細(xì)胞按3∶1相互作用后,按上述方法標(biāo)記FITC-CD56和PE-Cy 5.5-CD107a抗體,FCM檢測(cè)熒光標(biāo)記雙陽(yáng)性細(xì)胞占總NK細(xì)胞的比例。同時(shí),按相同方法標(biāo)記設(shè)未加靶細(xì)胞的NK細(xì)胞,檢測(cè)其自發(fā)CD107a分子的表達(dá),以單純PMA/Ionomycin刺激作為陽(yáng)性對(duì)照。流式雙標(biāo)記點(diǎn)圖中,(Q2/Q2+Q4)×100即表示 CD107a陽(yáng)性的NK細(xì)胞頻率(%)。最終NK細(xì)胞毒性的計(jì)算方法=加靶細(xì)胞刺激的 CD107a陽(yáng)性率(%)-CD107a自發(fā)表達(dá)率(%)。

2.2 CD107a抗體孵育時(shí)間對(duì)FCM檢測(cè)結(jié)果的影響

為阻止轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面的CD107a分子因膜內(nèi)吞而降低檢測(cè)陽(yáng)性率,Alter等使用莫能菌素抑制細(xì)胞膜的內(nèi)吞。但同時(shí)莫能菌素抑制高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性[9]。如果CD107a抗體在PBMCs與K562細(xì)胞剛孵育時(shí)就加入培養(yǎng)體系,該抗體可能與很多低活性狀態(tài)NK細(xì)胞(細(xì)胞膜通透性增加)內(nèi)囊泡上CD107a分子結(jié)合,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。

因此我們首先觀察莫能菌素與PBMC孵育4 h對(duì)NK細(xì)胞CD107a標(biāo)記的影響,在PBMC培養(yǎng)體系中(不含靶細(xì)胞)先加入CD107a抗體,1h后與莫能菌素孵育,4 h后標(biāo)記CD56抗體FCM檢測(cè),并與不加莫能菌素的PBMC進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)體系CD107a抗體與莫能菌素孵育4 h后,CD107a抗體標(biāo)記出現(xiàn)嚴(yán)重的假陽(yáng)性(圖2),提示莫能菌素對(duì)細(xì)胞有一定毒性。

圖1 顯示FCM檢測(cè)CD56+CD107a+細(xì)胞的流式分析結(jié)果

圖2 長(zhǎng)時(shí)間Monensin孵育引起C D107a標(biāo)記假陽(yáng)性

另外,我們對(duì)Alter等的方法進(jìn)行改進(jìn),分為2組:第1組在PBMCs與K562混合孵育的同時(shí)加入CD107a抗體,2 h后加莫能菌素,再孵育2 h標(biāo)記CD56抗體;另一組PBMCs與 K562混合,孵育2h加莫能菌素,孵育1.5h后同時(shí)標(biāo)記CD107a和CD56抗體。結(jié)果顯示,第 1組 NK細(xì)胞的CD107a自發(fā)陽(yáng)性率與加入 K562細(xì)胞的 CD56+CD107a+細(xì)胞頻率無明顯區(qū)別,而第2組NK細(xì)胞的CD107a自發(fā)陽(yáng)性率明顯降低,加入靶細(xì)胞后CD56+CD107a+細(xì)胞頻率可達(dá)自發(fā)CD107a陽(yáng)性率的8倍(圖3)。

圖3 CD107a抗體孵育時(shí)間對(duì)FCM檢測(cè)結(jié)果的影響

2.3 不同效靶比例對(duì)FCM檢測(cè)結(jié)果的影響

為觀察不同PBMCs與K562的比例對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 ,分別以 2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1 、40∶1的比例按上述第2組方法檢測(cè)了2例不同正常個(gè)體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著效靶比例的增高,未觀察到CD56+CD107a+細(xì)胞頻率的明顯提高(圖4)。因此我們又深入分析PBMCs與K562細(xì)胞按3∶1、1∶1和1∶3的比例相互作用,發(fā)現(xiàn)隨著效靶比例的降低,CD56+CD107a+細(xì)胞頻率同樣相應(yīng)降低(圖5),提示使用該方法檢測(cè)細(xì)胞毒活性時(shí),并不需要較高的效靶比例就能得到明顯結(jié)果。

2.4 CD107a檢測(cè)法與傳統(tǒng)LDH釋放法的關(guān)聯(lián)

為觀察該實(shí)驗(yàn)方法與傳統(tǒng)LDH釋放法檢測(cè)結(jié)果的一致性,取同一個(gè)體的外周血,分別用CD107a標(biāo)記和LDH法評(píng)估NK細(xì)胞毒活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)效靶比例分別為1∶3、1∶1、3∶1 時(shí),2 種方法均顯示殺傷效率隨之增高,而CD107a標(biāo)記法的數(shù)值相應(yīng)增高(圖6),提示該方法比LDH法更為敏感。

圖4 高效靶比對(duì)CD107陽(yáng)性NK細(xì)胞頻率無明顯影響

圖5 低效靶比對(duì)CD107陽(yáng)性NK細(xì)胞頻率正相關(guān)

圖6 CD107a標(biāo)記法與LDH釋放法檢測(cè)結(jié)果一致

3 討 論

本研究基于NK細(xì)胞釋放其胞內(nèi)穿孔素、顆粒酶的同時(shí),CD107a分子向細(xì)胞膜遷移的現(xiàn)象,檢測(cè)CD107a陽(yáng)性NK細(xì)胞的頻率以反映具有細(xì)胞毒活性NK細(xì)胞的頻率,從而間接反映NK細(xì)胞的殺傷活性。另外,該方法不僅被證明所需效應(yīng)細(xì)胞少、比LDH釋放法敏感,還因改進(jìn)CD107a抗體的孵育時(shí)間,降低了因莫能菌素的細(xì)胞毒性導(dǎo)致CD107a標(biāo)記假陽(yáng)性的現(xiàn)象。因此,我們?cè)诖顺晒⒁环N基于CD107a標(biāo)記而檢測(cè)NK細(xì)胞毒活性的實(shí)驗(yàn)方法,具有簡(jiǎn)單、快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)。

正常NK細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)CD107a分子,但受靶細(xì)胞刺激后可大量表達(dá)于細(xì)胞膜表面[10],本實(shí)驗(yàn)證實(shí)NK細(xì)胞膜表面CD107a自發(fā)表達(dá)的頻率很低,位于1.2%～5.8%。另外,因該方法主要涉及NK細(xì)胞膜表面CD107a的檢測(cè),保持NK細(xì)胞活力以維持細(xì)胞膜完整性尤為重要。NK細(xì)胞胞漿內(nèi)含有大量包裹顆粒酶的囊泡結(jié)構(gòu),這些細(xì)胞器的膜上均含有CD107a分子[11],如果NK細(xì)胞活力降低引起細(xì)胞通透性增加,則抗體分子將穿過細(xì)胞膜引起與胞內(nèi)CD107a分子的結(jié)合,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。我們證實(shí)雖然莫能菌素可抑制NK細(xì)胞膜的內(nèi)吞,卻對(duì)NK細(xì)胞的活力產(chǎn)生一定影響,預(yù)先加入CD107a抗體長(zhǎng)時(shí)間孵育將引起嚴(yán)重的背景染色(圖2),表現(xiàn)為Q1、Q2象限內(nèi)均出現(xiàn)大量的CD107a陽(yáng)性細(xì)胞。

為阻止因細(xì)胞膜內(nèi)吞導(dǎo)致CD107a檢測(cè)的假陰性結(jié)果,莫能菌素的使用絕對(duì)必要。盡管Alter等采取NK細(xì)胞與靶細(xì)胞孵育時(shí)即加入CD107a抗體的方法,可從最大程度上保證CD107a分子檢測(cè)的陽(yáng)性率,但容易引起假陽(yáng)性。在本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體系中,我們將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞孵育2 h,充分刺激NK細(xì)胞后再加入莫能菌素,一方面降低莫能菌素對(duì)NK細(xì)胞的毒性,另一方面只要CD107a分子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜,因莫能菌素抑制CD107a的內(nèi)吞,加入CD107a抗體孵育半h即可與所有陽(yáng)性結(jié)合,而不會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)的假陰性。圖3顯示效靶細(xì)胞孵育后加入CD107a抗體標(biāo)記,Q1象限內(nèi)無明顯陽(yáng)性細(xì)胞;而效靶細(xì)胞孵育前加入CD107a抗體標(biāo)記,Q1象限出現(xiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞(CD56-細(xì)胞的著色)。

雖然51Cr釋放法和LDH釋放法檢測(cè)敏感性不同,但所檢測(cè)對(duì)象均是靶細(xì)胞的死亡率,所以靶細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)檢測(cè)特異性影響大。當(dāng)靶細(xì)胞數(shù)目固定時(shí),效靶比例越高,對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性越強(qiáng),靶細(xì)胞死亡率越高。而CD107a標(biāo)記法檢測(cè)的是效應(yīng)(NK)細(xì)胞,當(dāng)靶細(xì)胞數(shù)目固定時(shí),在較低的效靶比例范圍內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞越多,發(fā)揮殺傷活性的NK細(xì)胞數(shù)隨之增多。如果超出一定效靶比例時(shí),效應(yīng)細(xì)胞越多,CD107a陽(yáng)性 NK細(xì)胞頻率并不隨之升高(圖4,5)。因此,CD107a標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞毒活性時(shí)僅需少量效應(yīng)細(xì)胞,在檢測(cè)臨床標(biāo)本時(shí)具有優(yōu)越性。另外,由于CD107a分子在細(xì)胞表面的表達(dá)不受細(xì)胞因子分泌的影響[4],可通過流式細(xì)胞儀多色熒光標(biāo)記同時(shí)分析NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性和細(xì)胞因子分泌情況。

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