柯賢福,周莎桑,樓 琦,盧領(lǐng)群,戴方偉,薩曉嬰

(1.浙江大學動物科學學院,杭州 310029;2.浙江省醫(yī)學科學院省實驗動物中心,杭州 310013)

研究報告

實驗動物屏障系統(tǒng)微生物動態(tài)狀況

柯賢福1,2,周莎桑2,樓 琦2,盧領(lǐng)群2,戴方偉2,薩曉嬰2

(1.浙江大學動物科學學院,杭州 310029;2.浙江省醫(yī)學科學院省實驗動物中心,杭州 310013)

目的研究運行中的實驗動物屏障系統(tǒng)微生物的情況。方法采用沉降菌法、棉拭子法等方法,研究運行中的屏障系統(tǒng)不同區(qū)域、不同環(huán)境指標下屏障系統(tǒng)內(nèi)微生物的狀況。結(jié)果動態(tài)下的屏障系統(tǒng)微生物情況與國標 GB14925-2001中靜態(tài)環(huán)境有較大不同,動物飼養(yǎng)室和動物實驗室沉降菌濃度遠高于靜態(tài)要求;輔助區(qū)域在規(guī)范化消毒及嚴格管理的情況下,能達到國標要求。屏障系統(tǒng)的微生物情況存在一定的晝夜變化規(guī)律,在晚間出現(xiàn)峰值。結(jié)論合適的換氣次數(shù)可有效控制實驗動物屏障系統(tǒng)的沉降菌濃度;加強消毒及硬件的管理,是屏障系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的保障。

微生物;沉降菌;檢測;環(huán)境;實驗動物

實驗動物環(huán)境設(shè)施的國家標準主要針對的是靜態(tài)下的實驗動物設(shè)施[1],而運行中的實驗動物設(shè)施內(nèi)微生物的攜帶情況,國家標準未作明確規(guī)定,相關(guān)研究也不多見。本研究通過幾種不同的方法觀察實驗動物設(shè)施的動態(tài)微生物變化情況,以期發(fā)現(xiàn)微生物變化的規(guī)律并為實驗動物設(shè)施管理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 屏障系統(tǒng)設(shè)施情況

屏障環(huán)境動物實驗室,面積 500 m2,單走廊結(jié)構(gòu)。動物實驗區(qū)共 8個動物實驗室,為全新風模式;輔助功能區(qū)域包括內(nèi)準備間、潔具室、清潔走廊、二更、緩沖等,為回風部分再利用模式(圖 1)。實驗期間,該設(shè)施環(huán)境參數(shù)控制如下:溫度 20℃～24℃,相對濕度 60%～70%,噪音 <60 dB,相鄰房間梯度壓差 15～20 Pa,空氣潔凈度 7級 (輔助區(qū)域),晝夜明暗交替時間 12 h/12h。

圖 1 屏障環(huán)境動物實驗室平面布局圖Fig.1 The ichnography of animal lab

1.2 檢測儀器和試劑

BCJ-1型激光塵埃粒子計數(shù)器 (江蘇省吳縣市華達儀器設(shè)備廠);475-000-FM手持式數(shù)字壓差計(美國Dwyer);Testo608-H1型溫濕度表 (德圖儀表有限公司);SPX-150BS-II型生化培養(yǎng)箱 (上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (杭州微生物試劑有限公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 棉拭子法:采用拭子法[2],檢查屏障系統(tǒng)各個功能區(qū)域的墻壁、地面、飼養(yǎng)器械等表面的微生物分布情況。主要包括:一更、二更、鞋柜、無菌衣柜、風淋室、緩沖間、傳遞窗、內(nèi)準備間、清潔走廊、動物實驗室等。于環(huán)境消毒處理前、后分別進行采樣。用 5 cm ×5 cm的標準滅菌規(guī)格板,放在被檢物體表面,采樣面積≥100 cm2,連續(xù)采樣 4個,用浸有含中和劑的無菌洗脫液的棉拭子 1支,在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返均勻涂擦各 5次,并隨之轉(zhuǎn)棉拭子,剪去手接觸部位后,將棉拭子投入 10 mL含中和劑的無菌洗脫液試管內(nèi),立即送檢。

將采樣管在混勻器上振蕩 20 s或用力振打 80次,用無菌吸管吸取1.0 mL待檢樣品接種于滅菌平皿,每一樣本接種 2個平皿,內(nèi)加入已溶化的 45℃～48℃的營養(yǎng)瓊脂 15～18 mL,邊傾注邊搖勻,待瓊脂凝固,置 37℃培養(yǎng) 48 h,計數(shù)菌落數(shù)。

1.3.2 沉降菌法:采用沉降菌法,用普通營養(yǎng)瓊脂進行落下菌的測定。培養(yǎng)基經(jīng)過高壓滅菌器滅菌后倒入直徑 9 cm的一次性平皿內(nèi),4℃保存。沉降菌檢測時,分別于不同的功能區(qū)域擺放平皿,30 min后進行 37℃培養(yǎng) 48 h,計數(shù)菌落數(shù)。

布點方法:室內(nèi)面積≤30 m2,設(shè)內(nèi)、中、外對角線 3點,內(nèi)、外點布點部位距墻壁 1 m處;室內(nèi)面積>30 m2,設(shè) 4角及中央 5點,4角的布點部位距墻壁1 m處。

采樣方法:將普通營養(yǎng)瓊脂平板放在室內(nèi)各采樣點處,采樣時將平板蓋打開,扣放于平板旁,暴露30 min,蓋好立即送檢。采樣期間,禁止人員走動。

2 結(jié)果

2.1 棉拭子法測試不同區(qū)域細菌情況

采用棉拭子的方法,分別于消毒前后從傳遞倉、內(nèi)準備間、二更、清潔走廊、沙鼠室、大鼠室及空實驗室的墻壁進行采樣。動物實驗室的墻壁所攜帶菌落數(shù)顯著高于輔助區(qū)域 (P<0.05);沙鼠實驗室的菌落數(shù)顯著高于大鼠實驗室 (P<0.05)。消毒前后的比較,輔助區(qū)域菌落數(shù)有減少的趨勢,而動物實驗室則顯著降低?？諏嶒炇乙蛭达曫B(yǎng)動物且保持通風狀態(tài),故潔凈狀態(tài)前后較為一致,菌落數(shù)較少(表 1)。

表 1 棉拭子法不同區(qū)域細菌情況Tab.1 The number of bacteria among different areas by swab test

2.2 沉降菌法消毒前后不同區(qū)域菌落數(shù)比較

采用沉降菌測試法,連續(xù)監(jiān)測不同區(qū)域 (動物實驗室、輔助區(qū)域)消毒前后的沉降菌濃度變化情況。沙鼠和大鼠實驗室的沉降菌濃度隨著時間的變化呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律,均在晚上 21時至 24時出現(xiàn)峰值,且沙鼠實驗室的沉降菌數(shù)始終高于大鼠實驗室 (圖 2)。輔助區(qū)域在消毒后菌落數(shù)有所降低,除清潔走廊外,空實驗室、內(nèi)準備間、二更、緩沖均能始終維持在國標中靜態(tài)環(huán)境所要求的 3 cfu/皿,φ9 cm,30 min以內(nèi)(圖 3)。

圖 2 動物實驗室沉降菌濃度變化情況Fig.2 Airfall bacteria number of animal lab

圖 3 輔助區(qū)域沉降菌變化情況Fig.3 Airfall bacteria number of functional areas

2.3 不同換氣次數(shù)下沉降菌濃度的比較

在保持相同動物密度及梯度壓差等指標相對一致的情況下,先后設(shè)置動物室換氣次數(shù)為 10次/h、15次/h,觀察各動物實驗室及輔助區(qū)域沉降菌濃度的變化情況。輔助功能區(qū)及空實驗室沉降菌濃度未見明顯差異,但數(shù)量均較少,且在國標范圍內(nèi);沙鼠室和大鼠室在 15次/h的換氣次數(shù)下,沉降菌濃度顯著降低 (P<0.05)(圖 4)。

圖 4 不同換氣次數(shù)下各區(qū)域沉降菌情況Fig.4 Airfall bacteria of different ventilation rate among different areas

3 討論

實驗動物的環(huán)境是封閉式人工環(huán)境,包括氣候因素(溫度、濕度、風速等)、物理化學因素 (換氣次數(shù)、塵埃粒子、噪音、照度等)、生物因素 (微生物等)等。實驗動物的環(huán)境因素對動物實驗的結(jié)果產(chǎn)生重要的影響。進行動物實驗時,為了保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性與可靠性,需要盡可能的控制這些影響因素。動物室空氣中浮游著通過動物和人或飼養(yǎng)籠器具帶進來的細菌、病毒、立克次體等。這些微生物在適當?shù)臏?、濕度和營養(yǎng)條件下會迅速增殖。病原性微生物污染動物室后,會造成動物繁殖效果差和動物實驗的混亂乃至動物死亡。因此,屏障系統(tǒng)的運行過程中,動物進入要先進行檢疫,人員進出需洗手、淋浴、更衣,空氣則要經(jīng)過三級過濾,籠器具及實驗器材要進行滅菌、消毒后方可使用,即用各種手段防止微生物侵入動物室內(nèi),使設(shè)施的內(nèi)環(huán)境保持相對獨立。

動物室的空氣中細菌數(shù)目是反應(yīng)設(shè)施中微生物污染程度的一個重要指標。空氣中細菌檢測分靜態(tài)和動態(tài)兩種。設(shè)施啟用前的沉降菌檢測屬于靜態(tài)檢測,目的是了解設(shè)施是否具備維持飼養(yǎng)動物所需的充分的清潔度的性能。由于是沒有飼養(yǎng)動物的狀態(tài),故其測定的結(jié)果變化因素少[3];而作為飼養(yǎng)動物狀態(tài)下動物室的潔凈情況的檢測,動態(tài)細菌監(jiān)測對于了解屏障設(shè)施的運行狀態(tài),監(jiān)控內(nèi)環(huán)境的清潔程度有著重要的意義。動態(tài)監(jiān)測是在飼養(yǎng)動物狀態(tài)下進行的,其測定結(jié)果因溫度、濕度、換氣次數(shù)、飼養(yǎng)密度、籠盒結(jié)構(gòu)、墊料、動物活動期、人員工作時期、采樣地點等因素的變化而有較大的變動。

通過棉拭子法可看出,動物設(shè)施的墻壁及地面附著大量的微生物,尤其是動物飼養(yǎng)室和動物實驗室,因為動物的活動,使得微生物數(shù)量遠多于沒有動物的輔助區(qū)域。因此,加強對環(huán)境的消毒是必要的,且在消毒過程中,不可忽視對墻壁、屋頂?shù)牟潦?、噴霧,還應(yīng)經(jīng)常用消毒藥水拖地,這些部位都是容易滋生細菌的地方。

動物有其較為固定的活動周期,故動物室的沉降菌濃度也隨之呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。動物晚間活動較為頻繁,從而導(dǎo)致夜間動物室的空氣質(zhì)量相對較差,空氣中的細菌數(shù)也明顯增加,尤其是晚上 21時至凌晨零時表現(xiàn)更為突出。此外,在上午工作人員進行實驗操作期間,沉降菌濃度也呈現(xiàn)較為明顯的升高,幾乎達到全天峰值。屏障系統(tǒng)中,人員的進入和操作活動室污染屏障潔凈環(huán)境的最大污染源[4]。建議考慮在上述時間段采用增加換氣次數(shù)的方法來改善動物室空氣質(zhì)量,同時便于將大量產(chǎn)生的細菌攜帶出屏障設(shè)施之外,以保證室內(nèi)的潔凈情況。

屏障系統(tǒng)動物實驗室多為亂流,其室內(nèi)氣流有一部分要循環(huán)流動,因此,動態(tài)環(huán)境下,亂流屏障系統(tǒng)動物實驗室的細菌是較難控制的[5]。適當?shù)脑黾訐Q氣次數(shù),能供給動物新鮮空氣,對除去動物室內(nèi)惡臭物質(zhì)有重要作用,也與粉塵、微生物的控制有直接聯(lián)系。15次/h的換氣次數(shù)下,大鼠實驗室、沙鼠實驗室的沉降菌濃度分別降低 48.7%、44.7%,因此,建議動物實驗室的換氣次數(shù)應(yīng)不低于 15次/h。

輔助區(qū)域 (二更、緩沖、內(nèi)準備、清潔走廊)的微生物攜帶情況遠遠好于動物實驗室,其沉降菌濃度基本均在靜態(tài)國標要求的 3 cfu/皿以內(nèi)。這也說明屏障系統(tǒng)通過合理消毒與嚴格管理,是可以有效保持其微生物潔凈狀況的。同時可看出,清潔走廊的沉降菌濃度始終高于其它輔助區(qū)域,且間斷出現(xiàn)超過 3 cfu/皿的情況,初步認為有兩方面原因:一是本屏障系統(tǒng)為單走廊結(jié)構(gòu),污潔的籠具、人員、動物、物品均需通過該區(qū)域,從而造成清潔走廊從空間上無法劃分潔污流線,只能依靠時間差來區(qū)分,勢必會造成該區(qū)域潔凈情況稍差[6];二是該區(qū)域與動物實驗室相鄰,動物室相對于清潔走廊為正壓,部分空氣會壓入到該區(qū)域,而室內(nèi)的沉降菌數(shù)遠高于走廊,故引起其沉降菌濃度有所增加。但清潔走廊的沉降菌濃度遠低于動物室,管理到位的情況下,能控制在較低水平。能否據(jù)此將清潔走廊的沉降菌情況作為間接反映實驗動物屏障系統(tǒng)動態(tài)微生物狀況的一個參數(shù),值得進一步的探討。

[1] 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 .GB14925—2001,實驗動物環(huán)境及設(shè)施[S].

[2] 孫俊,周明浩,徐燕,等.消毒技術(shù)與應(yīng)用[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003:346-347.

[3] 薛敬禮,杜春燕,王純耀,等.實驗動物環(huán)境設(shè)施技術(shù)指標的探討[J].中國比較醫(yī)學雜志,2006,16(6):362-364.

[4] 尹松林,傅江南,王洪軍,等.實驗動物獨立通氣籠盒系統(tǒng)設(shè)計與應(yīng)用[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2008:23.

[5] 宗阿南,史曉萍,福山侑榮,等.屏障系統(tǒng)動物室單向流與亂流空氣凈化方式的細菌比較分析[J].中國比較醫(yī)學雜志, 2007,17(8):476-477.

[6] 何婧,沈晉明.實驗動物設(shè)施的污染控制與布局[J].潔凈與空調(diào)技術(shù),2005,1:34-40.

Dynam ic Status of Germ in Laboratory An imals'Barrier System

KE Xian-fu1,2,ZHOU Sha-sang2,LOU-Qi2,LU Ling-qun2,DA I Fang-wei2,SA Xiao-ying2
(1.College ofAnimal Sciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310029,China; 2.Center ofLaboratoryAnimal,ZhejiangAcademy ofMedical Sciences,Hangzhou 310013,China)

ObjectiveTo study the dynamic situation of ger m about laboratory animals'barrier system。MethodsUsing cotton pledget to test the concentration of bacteria in different area of barrier system,aswell as through themethod of airfall bacteria。ResultsThe results showed that in dynamic enviroment,especially in animal laboratory rooms,the airfall bacteria was farmore than static condition which has been l imited below 3cfu/dish in the National Standards forLaboratory An imal Environment and Facility(GB14925-2001),but in functional rooms the condition was so good that could meet the demand of national standard under the situation that the barrier could be normally sterilized and be managed well.We also found that the airfall bacteria of barrier had regulation that usually had a peak value from 21:00 to 0:00。Conclusions Suitable ventilation rate,possible enviromental disinfection and good management can make the inner environment of laboratory an imal barrier system steady.

Microorganis ms;Airfall bacteria;Test;Enviroment;Laboratory animal

R-33

A

1671-7856(2010)03-0047-04

2009-11-03

浙江省實驗動物科技計劃項目(編號:2007F80009)。

柯賢福(1980-),男,助理研究員,碩士研究生,研究方向:實驗動物質(zhì)量檢測與動物實驗。

薩曉嬰(1952-),男,研究員,研究方向:實驗動物科研及管理。E-mail:saxiaoyin@163.com