張愛芝,張煥萍,藺鵬翔

(1.山西醫(yī)科大學(xué),太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科,太原 030001)

研究報(bào)告

ERK活化對哮喘大鼠氣道重塑及CyclinD1表達(dá)的影響

張愛芝1,張煥萍2,藺鵬翔1

(1.山西醫(yī)科大學(xué),太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科,太原 030001)

目的探討細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)對哮喘大鼠氣道重塑及 CyclinD1表達(dá)的作用。方法原代培養(yǎng)大鼠的平滑肌細(xì)胞(AS MCs),給予 ERK激動劑表皮生長因子 EGF和抑制劑 PD98059干預(yù)AS MCs生長,依處理方式不同分為 5組:(1)正常對照組 (2)哮喘對照組;(3)E組:EGF20 ng/mL;(4)P+E組,PD98059 10 μmol/L 1 h后添加 EGF 20 ng/mL;(5)PD組,PD98059 10μmol/L。采用四甲基偶氮唑鹽 (MTT)法檢測氣道平滑肌細(xì)胞(AS MCs)增殖能力,流式細(xì)胞術(shù) (FCM)測定細(xì)胞周期和 cyclinD1的蛋白含量,RT-PCR方法檢測 cyclinD1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果(1)與哮喘對照組比較,E組AS MCs S+G2/M期比例、吸光度 A值、cyclinD1蛋白陽性表達(dá)率和 cyclinD1 mRNA的A值均顯著升高,PD組均顯著降低(P<0.05)。P+E組與哮喘對照在此 4項(xiàng)指標(biāo)上比較無明顯差異。(2)哮喘(對照組、E組、PD組和 P+E組)組與正常對照組,其 S+G2/M期比例、吸光度 A值、cyclinD1蛋白和 cyclinD1 mRNA的表達(dá)均顯著增高 (P<0.05)。結(jié)論ERK活性促進(jìn)哮喘大鼠AS MCs的增殖,增加 cyclinD1在哮喘平滑肌細(xì)胞中的表達(dá),導(dǎo)致氣道重塑的形成,提示 ERK可能對 CyclinD1的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

CyclinD1;細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶;氣道重塑;哮喘

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 (ERK)是絲裂原活化蛋 白 激 酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的一個(gè)亞族,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生理病理過程,特別是在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過程中起著重要的作用[1],研究證實(shí),D1類細(xì)胞周期蛋白 (cyclinD1)主要存在與氣道平滑肌細(xì)胞,在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期 G1期向 S期轉(zhuǎn)變的過程中起關(guān)鍵作用[2]。細(xì)胞周期的進(jìn)行依賴于 ERK的持續(xù)激活和核內(nèi)的滯留[3]。目前 ERK對哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)控的確切機(jī)制尚未闡明,以及 ERK對哮喘大鼠平滑肌細(xì)胞 CyclinD1調(diào)控的相關(guān)研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平和基因水平探討 ERK對在哮喘平滑肌細(xì)胞增殖的作用和對 CyclinD1表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級健康雄性W istar大鼠山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供 (合格證號:山醫(yī)字第 070101)。ERK特異性激活劑表皮生長因子 (EGF)及抑制劑PD98059購自美國 Peprotech公司;抗 cyclinD1抗體購于 Santa Cruz公司;其余為進(jìn)口或國產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 AS MCs的培養(yǎng)鑒定:用OVA制備 6周哮喘模型,原代培養(yǎng)大鼠平滑肌細(xì)胞,通過形態(tài)學(xué)觀察和小鼠平滑肌α-肌動蛋白 (α-actin)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定為AS MCs。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)的第 3～6代氣道平滑肌細(xì)胞,換無血清DMEM培養(yǎng) 24 h,使細(xì)胞生長同步于 G0期,換用含 10%FBS的DMEM液,再分別應(yīng)用 ERK激活劑 EGF及抑制劑 PD98059干預(yù)AS MCs,根據(jù)給藥方式不同分為 5組:(1)正常對照組;(2)哮喘對照組;(3)E組,EGF 20 ng/mL;(4)P +E組,PD98059 10μmol/L 1 h后添加 EGF20 ng/ mL,細(xì)胞培養(yǎng)再持續(xù) 24 h;(5)PD組,PD98059 10 μmol/L。干預(yù)后的 AS MCs放入 CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng) 12 h,進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。每 5個(gè)復(fù)孔/瓶為一組,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析 AS MCs細(xì)胞周期:收集各組的AS MCs用 PBS制成濃度為 1×107/mL的細(xì)胞懸液,用 -20℃預(yù)冷的 75%乙醇在 4℃過夜固定,離心后加入 RNA酶 37℃作用 30 min后,再加入 PI室溫避光 30 min,直接用 FACsort型流式細(xì)胞儀(型號:BECK MAN)檢測,Cell quest軟件分析細(xì)胞周期中各期所占的百分比。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)微量比色法測定AS MCs增殖:消化各組平滑肌細(xì)胞制成濃度為 1.0 ×107cells/L的細(xì)胞懸液,每孔 200μL接種于 96孔板。使細(xì)胞同步化后再換成各組的培養(yǎng)液培養(yǎng) 16 h,之后每孔加 20μL(5 g/L)MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,加入 150μL二甲基亞砜 (DMSO)溶液,振蕩 30 min后,用酶聯(lián)免疫檢測儀于 490 nm比色測定。結(jié)果以A值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀測定 AS MC中 cyclinD1的表達(dá)情況:取同代的各組 AS MC制成 5×107cells/L濃度,用 0.01 mol/LPBS液洗 2次;加 50μL細(xì)胞固定液,室溫靜置 15 min,用 0.01 mol/L PBS液洗滌細(xì)胞后,1500 r/min離心 5 min,棄上清的細(xì)胞碎片;加50μL細(xì)胞破膜劑,避光靜置 10 min后,直接加 9 μL鼠抗 cyclinD1單抗 (設(shè)一空白對照組),混勻避光室溫孵育 30 min;用 PBS液洗 2次,再加 8μL的FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG,常溫避光染色 30 min后,再PBS液洗 2次,棄去上清液,加 500μL PBS直接用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,Multicyle軟件分析各組細(xì)胞表達(dá) CyclinD1的陽性百分率,用陽性細(xì)胞表達(dá)百分率值表示 cyclinD1蛋白的相對含量,檢測重復(fù) 3次。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR)檢測CyclinD1的 mRNA表達(dá)水平:CyclinD1引物序列:上游:5′-GCG TAC CCT GAC ACC AAT CT-3′下游: 5′-GGC TCC AGA GAC AAG AAA CG-3′擴(kuò)增產(chǎn)物片斷為 232bp。GAPDH引物序列:上游 5′TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3′,下游 5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG GA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片斷 307 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 2 min,94℃變性 20 s,58℃退火 1 min,72℃延伸 30 s,共進(jìn)行 32個(gè)循環(huán),最后72℃延伸 5 min,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳,采用 Quantity one 4.6軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物條帶灰度值(A):取目的基因與 GAPDH的A值的比值為該目的基因的相對含量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件包 SPSS13. 0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx± s)表示,多組間比較采用 F檢驗(yàn),兩兩之間比較采用 q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定(圖 1～2見彩插 2)

經(jīng)原代培養(yǎng)的AS MCs在倒置顯微鏡下為典型“峰和谷”生長狀態(tài)(圖 1)。α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性,即所培養(yǎng)的細(xì)胞鑒定為平滑肌細(xì)胞[4](圖 2)。

2.2 細(xì)胞增殖活性檢測

2.2.1 流式細(xì)胞儀分析 AS MCs細(xì)胞周期:哮喘對照組與正常對照組相比,S+G2/M期細(xì)胞所占比例明顯升高(P<0.05)。EGF處理組 S+G2/M期細(xì)胞所占比例與哮喘對照組相比,明顯增高 (P< 0.05);PD處理組則明顯減少 (P<0.05)。P+E組與哮喘對照組比較,差異不顯著 (表 1)。

2.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖:與哮喘對照組 A490值相比,哮喘 E組 A490值增高,哮喘 PD組 A值降低,差異均顯著(P<0.05)。哮喘 P+E組與正常對照組比較,A值升高,差異顯著 (P<0.05);哮喘 P+ E組與哮喘對照組比較差異不顯著(表 1)。

表 1 AS MCs增殖活性表達(dá)情況Tab.1 Proliferation levels ofAS MCs in each group

2.3 哮喘大鼠 ASMCs的 cyclinD1蛋白和cycl inD1mRNA表達(dá)

圖 3 用 FCM測哮喘平滑肌細(xì)胞 CyclinD1的表達(dá)Fig.3 CyclinD1 expression ofAS MCswere detected by FCM

如圖 3、4所示,與哮喘對照組比較,EGF組和PD組 cyclinD1蛋白和 cyclinD1 mRNA的表達(dá)分別為 (1.419±0.401)、(0.716±0.064),差異顯著 (P <0.01)。P+E組與哮喘對照組比較cyclinD1蛋白和mRNA的表達(dá)差異不顯著。P+E組與正常空白組比較,A值比值上升;與 PD組比較A值下降,差異均顯著。cyclinD1蛋白表達(dá)與 cyclinD1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。

圖 4 大鼠AS MCs CyclinD1 mRNA表達(dá)Fig.4 RT-PCR amplification of Expression of CyclinD1 mRNA in AS MCs

3 討論

哮喘是以氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑為特征的慢性疾病,氣道平滑肌細(xì)胞的異常增殖是參與哮喘氣道重塑的重要因素[5]。本研究的目的在于研究 ERK對平滑肌細(xì)胞增殖的作用及對CyclinD1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

Duan和 Wong等[6]研究顯示 ERK抑制哮喘氣道炎癥的形成,激酶抑制劑通過抑制炎癥反應(yīng)來治療哮喘。目前 ERK對細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制是一個(gè)研究的熱點(diǎn)[7],為了更好的闡明 ERK信號通道對哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及對CyclinD1作用的研究,本實(shí)驗(yàn)采用 ERK激動劑 EGF和抑制劑 PD98059分別干預(yù)平滑肌細(xì)胞的增殖。哮喘對照組AS MCs細(xì)胞增殖水平明顯高于正常對照組,提示哮喘平滑肌細(xì)胞增殖活躍。給予 ERK激動劑 EGF的刺激后,AS MCs細(xì)胞增殖水平明顯增高;給予 ERK抑制劑 PD98059則抑制細(xì)胞增殖,提示 ERK的活性與細(xì)胞增殖水平密切相關(guān),與張曉宇研究一致[8]。PD98059阻止了部分 EGF的作用,這表明在慢性哮喘大鼠平滑肌細(xì)胞增殖中 ERK起了重要的促進(jìn)作用,進(jìn)一步證實(shí) ERK信號通路參與了大鼠平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控。

近年來對細(xì)胞增殖周期的研究表明[9]:細(xì)胞周期調(diào)控是在各期的控制點(diǎn)上進(jìn)行的,細(xì)胞周期中存在兩個(gè)重要的調(diào)控點(diǎn):G1/S和 G2/M期調(diào)控點(diǎn),只要 G1期內(nèi)的正性調(diào)節(jié)因子累積達(dá)到一定程度,周期越過 G1/S交界點(diǎn),以后細(xì)胞就不再依賴于細(xì)胞外促生長因子而順序完成整個(gè)細(xì)胞周期,因而 G1/S調(diào)控點(diǎn)是影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵。CyclinD1特異性地表達(dá)于細(xì)胞增殖周期的 G1期,調(diào)控著 G0期細(xì)胞向G1期的轉(zhuǎn)化,是細(xì)胞增殖周期啟動的重要調(diào)控因子。Inoue等[10]研究報(bào)道在哮喘免疫方面 ERK對SPRED蛋白有調(diào)節(jié)作用,抑制 SPRED蛋白可作為治療哮喘的新策略,因此推測 ERK在哮喘平滑肌細(xì)胞增殖中對 CyclinD1有調(diào)節(jié)作用,抑制 CyclinD1表達(dá)可阻止哮喘氣道重塑。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對照組比較,哮喘對照組 cyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)增加,提示在哮喘平滑肌細(xì)胞中 cyclinD1表達(dá)活性提高。給予 EGF處理之后,cyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高;給予 PD98059處理AS MCs之后,cyclinD1mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低;這表明 ERK活性影響了 cyclinD1的表達(dá),同時(shí)細(xì)胞周期時(shí)相也發(fā)生了改變,即 S+G2細(xì)胞增加或減少,促進(jìn)或阻止了細(xì)胞從 G0/G1期向 S期轉(zhuǎn)化的進(jìn)程,提示 ERK的活性影響細(xì)胞周期的進(jìn)行,表明 cyclinD1在平滑肌細(xì)胞增殖中的表達(dá)與 ERK信號途徑存在密切的關(guān)系。聯(lián)合應(yīng)用 EGF和 PD98059組與哮喘對照組比較, cyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)水平無顯著變化,細(xì)胞周期時(shí)相也未發(fā)生變化,進(jìn)一步闡明了 ERK對哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖周期中的 cyclinD1可能具有調(diào)控作用。此外,聯(lián)合應(yīng)用 EGF+PD98059組的cyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)水平略低于哮喘對照組,表明 PD98059抑制作用大于 EGF激活 ERK活性促進(jìn) cyclinD1表達(dá)的作用,提示除了 ERK之外,也可能還存在其他機(jī)制對 cyclinD1表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ERK活化在哮喘大鼠AS MCs增殖中起重要作用,促進(jìn)哮喘氣道重塑的形成,對細(xì)胞周期蛋白 (cyclinD1)可能具有調(diào)控作用,明確 ERK對 cyclinD1的調(diào)控作用,可以把 ERK或cyclinD1作為靶點(diǎn)來抑制氣道重塑的形成,為治療哮喘提供新方向。但目前 ERK對細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期和多種蛋白的調(diào)控機(jī)制尚不清楚,如對 G2/M期及其它周期蛋白 (cyclinE、CDK4等)調(diào)控遠(yuǎn)未明了,還有待于進(jìn)一步深入研究。

[1] He H,Pannequin J,Tantiongco JP,et al.Glycine-extended gastrin stimulates cell proliferation and migration through a Rhoand ROCK-dependent pathway,not a Rac/Cdc42-dependent pathway[J].Am J Physiol GastrointestLiver Physiol,2005,289 (3):G478-488.

[2] Liu Y,Templeton DM.Iron-loaded cardiac myocytes stimulate cardiac myofibroblastDNA synthesis[J].Mol Cell Biochem, 2006,281(1-2):77-85.

[3] Ravenhall C,Guida E,Harris T,et al.The importance of ERK activity in the regulation of cyclinD1 levels and DNA synthesis in human cultured air way smooth muscle[J].Br J Pharmacol, 2000,131(1):17-28.

[4] 張曉宇,徐永健,劉先勝,等.香煙提取物經(jīng)級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)支氣管哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2009,32(5):390-393.

[5] Wang PY,Weng J,Anderson RG,et al.OSBP is a cholesterol regulated scaffolding protein in control of ERK 1/2 activation [J].Science,2005,307(5714):1472-1476.

[6] DuanW,WongWS.Targetingmitogen-activated protein kinases for asthma[J].CurrDrug Targets,2006,7(6):691-698.

[7] Roberts PJ,Der CJ. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogenactivated protein kinase cascade for the treatment of cancer[J]. Oncogene,2007,26:3291– 3310.

[8] 范曉燕,張煥萍.p-ERK1/2及 ERK2mRNA在哮喘大鼠氣道中的表達(dá)變化[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(3):14-18.

[9] Kavurma MM,Khachigian LM.ERK,JNK,and p38 MAP kinases differentially regulate proliferation and migration of phenotypically distinct smooth muscle cell subtypes[J].J Cell Biochem,2003,89(2):289-300.

[10] Inoue H,Fukuyama S,Matsumoto K,et al.Role of endogenous inhibitors of cytokine signaling in allergic asthma.Curr Med Chem.2007;14(2):181-189.

Effect of ERK on Asthmatic Rat A irway Remodeling and CyclinD1

ZHANGAi-zhi1,ZHANG Huan-ping2,L IN Peng-xiang1
(1.Shan XiMedicalUniversity,Tai Yuan 030001,China;2.Department of Respiration First Affiliate Hospital of Shan XiMedicalUniversity,Tai Yuan 030001,China)

ObjectiveTo investigate the effects of ERK on asthma air way remodeling and the expressions of cyclinD1。MethodsThe rat asthma model was made through ovalbumin(OVA)sensitization and excitation.Primary cultures ofAS MCswere established and cells between passages 3 and 6 were used for experiments.AS MCs were treated with ERK activator epidermal growth factor(EGF)and inhibitor PD98059,and then subdivided into 5 groups based on the drug interventions:(1)Normal control group;(3)Asthmatic control group;(3)Asthmatic EGF group;(4)P+E group, PD98059 10μmol/L+EGF 20 ng/mL;(5)PD98059 group.The proliferations ofAS MCswere examined with cell cycle analysis and MTT colorimetric assay,the expressions of cyclinD1 mRNA were detected by RT-PCR,and the protein expression of cyclinD1 wasmeasured by FCM。ResultsCompared to asthmatic control group,the percentage of cells at S +G2/M phase,Avalue,the expression of cyclinD1 mRNA and cyclinD1 protein from E group were significantly increased (P<0.05);the PD group were significantly reduced respectively(P<0.05).There was no significant difference between P+E group and the asthmatic control group in the above four index. (2)Compared with normal control group,the percentage of cells at S+G2/M phase,Avalue,the expression of cyclinD1 mRNA and cyclinD1 protein from asthmatic group(control group,E group,P group and P+E group)were significantly increased(P<0.05)。ConclusionTheactivation of ERK promotesAS MCsproliferation and expressionsof cyclinD1 in asthmatic rats,indicating that the expression of CyclinD1 may be dependenton the ERK activation in asthmatic rats.The findingwill help to understand the mechanisms of airway remodeling.

CyclinD1;Extracellular signal-regulated kinase(ERK);Airway remodeling;Asthma

R563

A

1671-7856(2010)03-0026-04

2009-11-16

山西省教育廳 2005年山西省高校科技研究開發(fā)項(xiàng)目(20051001)。

張愛芝(1985-)女,碩士生,研究方向:哮喘發(fā)病機(jī)制的研究。E-mail:Aizhi2008@126.com

張煥萍,女,博士,碩士生導(dǎo)師。E-mail:zhp326@163.com