李小穎,蘇 衛(wèi),張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

研究報(bào)告

S W1990和 Capan-2紅色熒光標(biāo)記胰腺癌移植腫瘤模型的建立和比較

李小穎,蘇 衛(wèi),張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

目的建立穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白基因的人胰腺癌細(xì)胞系,為體內(nèi)監(jiān)測(cè)腫瘤的早期生長(zhǎng)及抗腫瘤藥物的藥效評(píng)價(jià)建立一種新的腫瘤動(dòng)物模型。方法以 Lipofectamine 2000介導(dǎo) chickenβ-actin-RFP-NEO轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞 S W1990和 Capan-2,經(jīng)梯度濃度 G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。BALB/ cA-nu裸鼠皮下接種 1×106個(gè)發(fā)光細(xì)胞使其成瘤,活體熒光成像系統(tǒng)觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果獲得了穩(wěn)定表達(dá) RFP的兩種不同的人胰腺癌細(xì)胞株,將其接種到裸鼠體內(nèi)可成瘤,利用活體成像系統(tǒng)觀察了腫瘤的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)過程,并且 S W1990腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較 Capan-2細(xì)胞快。結(jié)論用紅色熒光蛋白標(biāo)記的人胰腺癌細(xì)胞建立的裸鼠腫瘤模型為胰腺癌的研究和相關(guān)藥物篩選提供了可進(jìn)行熒光影像活體、動(dòng)態(tài)分析的動(dòng)物模型。

人胰腺癌細(xì)胞;紅色熒光蛋白;活體熒光成像系統(tǒng)

腫瘤細(xì)胞系 S W1990和 Capan-2均為源于男性白人的胰腺癌細(xì)胞,組織培養(yǎng),呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞特征;接種裸鼠后,組織病理學(xué)上類似于原發(fā)癌,腫瘤呈現(xiàn)高分化的腺癌樣生長(zhǎng)[1,2]。人胰腺癌細(xì)胞株S W1990為高轉(zhuǎn)移人胰腺癌細(xì)胞株,1978年取自一名 58歲胰尾癌并脾轉(zhuǎn)移的男性患者,CEA陽性, 1979年患者死于肝轉(zhuǎn)移。S W1990由美國(guó)學(xué)者Kyriazis等建株[1]。人胰腺癌細(xì)胞株 Capan-2取自胰腺導(dǎo)管腺癌,產(chǎn)生高水平粘蛋白 MUC-1的mRNA,低水平粘蛋白MUC-2的mRNA但是不表達(dá)粘蛋白MUC-3基因.目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要集中于胰腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究[3-7]。

本實(shí)驗(yàn)利用紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein,DsRed)基因分別標(biāo)記 S W1990和Capan-2腫瘤細(xì)胞,結(jié)合光學(xué)影像分析技術(shù),連續(xù)、動(dòng)態(tài)地觀察和比較兩種不同的人胰腺癌細(xì)胞在裸鼠皮下生長(zhǎng)及形成瘤體的過程,建立了光學(xué)腫瘤模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器:人胰腺癌細(xì)胞 S W1990和Capan-2本實(shí)驗(yàn)室凍存,L-谷氨酰胺 (G IBCO公司)、雙抗(G IBCO公司)、DMEM(G IBCO公司)、胎牛血清 (G IBCO公司 )、G418(AMRESCO公司 )、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogene公司 )。Whole-body optical imaging system (I.C.E.,日本Roper公司)、倒置熒光顯微鏡(OLY MPUS IX71)、倒置顯微鏡 (Nikon TS100)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/cA-nu裸小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[XCXK(京)2007-0001],鼠齡 5周,體重 15～18 g,在本實(shí)驗(yàn)室無特定病原體 (specific-pathogen free,SPF)的飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn) (批準(zhǔn)號(hào)為 GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):用含 10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基作為S W1990和 Capan-2細(xì)胞的培養(yǎng)液,于 5%CO2,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建帶有篩選標(biāo)記的載體:chickenβ-actin-RFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[8,9]。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選:采用 Lipofectamine 2000 Reagent轉(zhuǎn)染 S W1990和 Capan-2細(xì)胞 (具體轉(zhuǎn)染步驟參照 Lipofectamine 2000 Reagent操作說明)。轉(zhuǎn)染后 24 h,用含 1000μg/mL G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞 3周,獲得穩(wěn)定表達(dá) RFP的細(xì)胞株,選擇其中高表達(dá)的克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞的植入及活體熒光成像:收集處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,稀釋至 5×106/mL。各取三只BALB/cA-nu裸鼠進(jìn)行皮下接種,1×106個(gè)細(xì)胞/只,每隔一周觀察一次,飽和三溴乙醇 (0.18 mL/10 g)麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像,Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定高表達(dá)D sRed的細(xì)胞株克隆

S W1990和 Capan-2采用脂質(zhì)體 2000轉(zhuǎn)染,用含 1000μg/mL G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞三周,獲得穩(wěn)定表達(dá) RFP的細(xì)胞株。穩(wěn)定高表達(dá) DsRed的兩種細(xì)胞,在熒光顯微鏡下均呈強(qiáng)熒光,并且熒光較均勻的分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。單克隆 DsRed細(xì)胞在無 G418篩選壓力下,傳代數(shù)次后仍能穩(wěn)定高水平表達(dá)DsRed(圖 1,彩插 1)。細(xì)胞形態(tài)和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯區(qū)別。

2.2 D sRed熒光標(biāo)記 SW 1990和 Capan-2小鼠腫瘤模型的動(dòng)態(tài)觀察

分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DsRed標(biāo)記的 S W1990和Capan-2腫瘤細(xì)胞皮下接種于 3只 BALB/cA-nu,1 ×106/只。在接種后的 7、14、21、28和 35 d觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。在接種的第 7天就可以觀察到腫瘤熒光,通過腫瘤組織發(fā)出的熒光的光子數(shù)確定腫瘤的大小,隨著觀察天數(shù)的增加,腫瘤的體積和發(fā)光強(qiáng)度增加,且具有很好的相關(guān)性 (圖 2和圖 3,彩插2)。以腫瘤細(xì)胞發(fā)射的光子數(shù)對(duì)小鼠荷瘤時(shí)間作圖得到熒光蛋白標(biāo)記的兩種不同腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)曲線 (圖 4),發(fā)現(xiàn) S W1990腫瘤明顯比Capan-2快。

3 討論

DsRed是紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein, RFP)的一種,是從印度洋-太平洋中?？嚓P(guān)的Discosoma sp中分離得到的生物發(fā)光蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為 28×103。它能在紫外線激發(fā)時(shí)發(fā)出紅色熒光,其最大激發(fā)波長(zhǎng)為 558 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為583 nm,且發(fā)射峰位于培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)玻璃器材及細(xì)胞成分等產(chǎn)生的熒光背景范圍之外[10]。RFP能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá),可用于示蹤活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及蛋白質(zhì)之間的相互作用等。與綠色熒光蛋白各種變異體比較,DsRed能提供更高的信噪比。而且,由于 DsRed為長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng),故細(xì)胞中熒光轉(zhuǎn)換效率更高,較短發(fā)射波長(zhǎng)的綠色和藍(lán)色熒光信號(hào)更為清楚。與其他報(bào)告基因比較,DsRed具有觀察方便、靈敏度高、對(duì)極端 pH值和光漂白抗性強(qiáng)、定性和定量測(cè)定方便等特點(diǎn),因而日益受到關(guān)注。

圖 4 紅色熒光標(biāo)記兩種胰腺腫瘤的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Thegrowthcurve of Capan-2-DsRedand S W1990-DsRed in vivo

活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)對(duì)疾病動(dòng)物模型微小病灶的檢測(cè)靈敏度極高,該技術(shù)能夠進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的動(dòng)物活體觀察,從而對(duì)同一實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的觀察,減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間差異,與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法相比,可以大大減少動(dòng)物的用量,符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則。本實(shí)驗(yàn)中將強(qiáng)啟動(dòng)子 chickenβ-actin啟動(dòng)的 RFP基因轉(zhuǎn)染到人胰腺癌細(xì)胞株 S W1990和 Capan-2中得到了高表達(dá)DsRed熒光蛋白細(xì)胞株。經(jīng)過多次傳代表達(dá)水平穩(wěn)定,標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)方式、生長(zhǎng)速度及致瘤能力等與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯差異,可以反映S W1990和 Capan-2腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的標(biāo)記細(xì)胞,其他標(biāo)記細(xì)胞的研究報(bào)道也證實(shí)了類似的結(jié)果[11]。將 RFP標(biāo)記的兩種人胰腺癌細(xì)胞經(jīng)皮下接種至BALB/cA-nu裸鼠,用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察,發(fā)現(xiàn)能夠成瘤,并且腫瘤的體積與發(fā)光強(qiáng)度有相關(guān)性,建立了一種新的能夠用于活體內(nèi)連續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)物模型。此癌癥模型利用無創(chuàng)傷活體熒光成像對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的檢測(cè),可對(duì)癌癥治療之前和過程中的癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估,可應(yīng)用于癌癥體內(nèi)用藥的療法中。另外,從兩種不同腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)S W1990腫瘤細(xì)胞的惡性程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 Capan-2腫瘤細(xì)胞,S W1990高肝轉(zhuǎn)移的人胰腺癌細(xì)胞株具有侵襲力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移效率高和轉(zhuǎn)移范圍廣的特點(diǎn),常用來深入研究胰腺癌肝轉(zhuǎn)移機(jī)理的理想細(xì)胞系[12-15]。綜上,活體成像系統(tǒng)具有較高的靈敏度,能夠客觀評(píng)價(jià) S W1990-Ds Ded和 Capan-2-DsRed細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況,為成像系統(tǒng)在胰腺癌的發(fā)展機(jī)制、藥物治療、基因治療等方面的研究提供重要的參考依據(jù)。

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The Establishment and Comparison of TwoM ouse Transplanted Tumor M odels with D sRed-labeled SW1990 and Capan-2 Human Pancreas Cancer CellL ines

L IXiao-ying,SU Wei,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratoryAnimal Science, Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&ComparativeMedicine Centre,PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish DsRed-labeled human pancreas cancer cell lines and to generate a noninvasive model for monitoring tumor growth in vivo.M ethod Human pancreas cancer cells of S W1990 and Capan-2 were transfected with chickenβ-actin-DsRed-neo byLipofectamine 2000 reagent and screened with G418 to produce the stable DsRed-expressing clone.Then the labeled S W1990 and Capan-2 cellswere implanted into the subcutaneous tissue of nude mice and the growth of the implanted tumorwas observed and analyzed with the whole-body optical imaging system.Result The stable DsRed-expressing S W1990 and Capan-2 cell lines were established and the cell line was used to duplicate the implanted tumormousemodel.The growth of the tumormasswith red fluorescentprotein labeled S W1990 and Capan-2 was observed after inoculation of the cells below dorsal blank ofBALB/cA-nu。ConclusionThe implanted tumormousemodel ofDsRed-labeled S W1990 and Capan-2 cell was established,which was a convenient model for the dynamic and in vivoresearch on the human pancreas cancer and drug discovery.

Human pancreas cancer cell;Red fluorescent protein;Whole-body optical imaging system

R541

A

1671-7856(2010)03-0012-03

2009-09-15

衛(wèi)生部行業(yè)基金,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類疾病動(dòng)物模型資源擴(kuò)展(200802036)和十一五新藥專項(xiàng)支持(2009ZX09501-026)。

李小穎,實(shí)習(xí)研究員,主要研究方向:人類疾病動(dòng)物模型。

張連峰。E-mail:zhanglf@cnilas.org