楊麗芬,周亞敏,李紹東,唐品超,吳志蕾,王 瓊

(中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物云南靈長類中心,昆明 650216)

技術(shù)方法

獼猴血清B病毒抗體三種檢測方法的比較

楊麗芬,周亞敏,李紹東,唐品超,吳志蕾,王 瓊

(中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物云南靈長類中心,昆明 650216)

目的對B病毒 (B virus)抗體檢測的 3種方法進(jìn)行比較,尋求準(zhǔn)確、可靠、經(jīng)濟(jì)的檢疫方法。方法對以 HSV-1為抗原的玻片酶免疫法、B病毒為抗原的玻片酶法(E IA)和酶聯(lián)免疫吸附法 (EL ISA)的獼猴血清B病毒抗體檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果HSV-1為抗原的 E IA與 B病毒為抗原的 E IA、EL ISA檢測結(jié)果符合率分別為97.7%和 95.5%。結(jié)論HSV-1為抗原 E IA的檢測結(jié)果與B病毒抗原 E IA和 EL ISA的檢測結(jié)果一致性較好,可以做為初篩手段,且檢測效果較好,投入資金相對最低,達(dá)到節(jié)約成本的目的。

獼猴;B病毒;抗體檢測

猴 B病毒屬于皰疹病毒科 (Herpetoviridae),甲型皰疹病毒亞科(Cercopithecine herpesvirus1)皰疹病毒屬(Herpesvirus),獼猴皰疹病毒(Herpesvirus sim iae)(B virus)[1]。獼猴是B病毒的自然宿主,又是醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中的重要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。人類感染猴B病毒表現(xiàn)為腦脊髓炎癥狀,目前醫(yī)療條件下,患者死亡率高[2]。因此要使用獼猴做實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,首先要求是B病毒陰性。檢測B病毒相關(guān)抗體是建立無B病毒感染 SPF猴群的基礎(chǔ)。人單純皰疹病毒(HSV-1、HSV-2)、與 SA8病毒 (見于非洲綠猴和狒狒的一種皰疹病毒)具有密切的抗原關(guān)系[3]?？刹捎肏SV-1作抗原,檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群中的 B病毒相關(guān)抗體[4]。

本文報(bào)道了用 HSV-1抗原建立的玻片酶免疫法(E IA)與B病毒為抗原的玻片酶免疫法 (E IA)及酶免疫吸附法 (EL ISA),對人工飼養(yǎng)獼猴血清 B病毒的檢測結(jié)果進(jìn)行比較,認(rèn)為 HSV-1抗原建立的玻片酶免疫法(E IA)可以作為廉價(jià)的初篩手段。

1 材料和方法

1.1 血清樣品

來源于中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物云南靈長類中心人工飼養(yǎng)的獼猴,靜脈采血,2500 r/min離心 30 min后,分離血清、-30℃保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 HSV-1玻片酶免疫法(E IA):用 HSV-1病毒株接種Vero細(xì)胞,在細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲并制成抗原片,建立起 E IA。HSV-1毒株來源于北京生物制品檢定所,Vero細(xì)胞引自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,羊抗猴 IgG酶結(jié)合物購自美國 Organon Teknika公司。血清稀釋度為 1∶5。

1.2.2 BVB玻片酶免疫法(E IA):BV抗原片(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,田克恭提供),HRPSPA工作濃度 1∶150,血清稀釋度 1∶5。

1.2.3 BV酶聯(lián)免疫吸附法 (EL ISA):由日本公司用B病毒抗原的 EL ISA試劑盒對我們用 HSV-1抗原 E IA方法的檢測結(jié)果進(jìn)行符合檢測。

2 結(jié)果

2.1 BVEIA與 HSV-1EI A法結(jié)果比較

用 HSV-1E IA法檢測為陽性的 37份樣品,經(jīng)BVE IA法檢測全部為陽性,而經(jīng) HSV-1檢測為陰性的 50份樣品,經(jīng)BVE IA法檢測 48份為陰性,2份為陽性。與 HSV-1E IA法相比,BVE IA法檢測陽性率為 44.8%,HSV-1E IA法檢測陽性率為 42.5%,兩者的符合率為 97.7%(表 1)。

表 1 兩種抗原的檢測結(jié)果比較Tab.1 Comparison of results of two antigens tests

2.2 HSV-1和 BVEL ISA的檢測結(jié)果的比較

用 HSV-1E IA方法檢測的 464份陰性血清樣本經(jīng)日本公司用BV抗的 EL ISA試劑盒檢測 464份陰性血清中 443份仍為陰性,21份為陽性 (4.5%)符合率為 95.5%(表 2)。

表 2 E IA法和 EL ISA法的檢測結(jié)果比較Tab.2 Comparison of results of E IA be tween EL ISA tests

3 討論

國內(nèi)眾多學(xué)者對B病毒檢測方法進(jìn)行過研究。吳小閑等[4]以 HSV-1為抗原,以中和試驗(yàn)為基礎(chǔ),建立了 E IA和 EL ISA法,并進(jìn)行了比較研究。在所檢 84份血清中,中和試驗(yàn)和 EL ISA檢測相符者 75份,符合率 89.3%;中和試驗(yàn)和 E IA檢測相符者 73份,符合率 86.9%。EL ISA和 E IA同是免疫酶技術(shù),二者比較兩種方法相符者 78份,符合率93.3%。結(jié)果表明兩種方法均可應(yīng)用于實(shí)際。就此以后,國內(nèi)各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室開展了技術(shù)引進(jìn)和創(chuàng)新,建立了各自的 E IA方法并廣泛應(yīng)用于科研和生產(chǎn)實(shí)踐中,取得了較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。王欣等[5]比較了用 HSV-1(E IA法)和 B病毒 (D IA試劑盒)檢查猴B病毒相關(guān)抗體和 B病毒抗體的結(jié)果: E IA法檢查出的B病毒相關(guān)抗體陰性猴,經(jīng) D IA試劑盒檢查有 99%的符合率,表明 E IA的結(jié)果與D IA試劑盒有較好的一致性。田克恭等[6]用 HSV-1E IA法和B病毒 D IA法同時(shí)檢測了 60份猴血清,結(jié)果前者陽性率 5%,后者為 10%,其中經(jīng) E IA法檢測為陽性的 3份猴血清,經(jīng) D IA法檢測均為陽性,而經(jīng)E IA法檢測為陰性的 57份猴血清中,經(jīng) D IA法檢測3份為陽性。二者的符合率 95%。筆者用 HSV-1E IA法檢測為陽性的 37份樣品,經(jīng)BVE IA法檢測全部為陽性,而經(jīng) HSV-1檢測為陰性的 50份樣品,經(jīng)BVE IA法檢測 48份為陰性,2份為陽性。與HSV-1E IA法相比,BVE IA法檢測陽性率為 44.8%, HSV-1E IA法檢測陽性率為 42.5%,兩者的符合率為 97.7%.由此可看出,自吳小閑等開創(chuàng)研究工作后,不同的單位與人員所做的類似試驗(yàn)共同的結(jié)果是:用相同的血清樣本在同一實(shí)驗(yàn)室,以不同的方法、不同的抗原進(jìn)行檢測,結(jié)果的符合率都達(dá) 95%以上。

王曉明等[7]采用以人單純皰疹病毒 (HSV-1)為抗原的 EL ISA法和酶免疫法 E IA在國內(nèi) 70份血清進(jìn)行檢測,結(jié)果 B病毒相關(guān)抗體為陰性。相同血清在國外測得 B病毒抗體陽性者有 7份,檢測結(jié)果的符合率為 90%。結(jié)果表明以 HSV-1為抗原不能檢出全部B病毒感染動(dòng)物。周亞敏等[8]以人單純皰疹病毒 HSV-1為抗原的 E IA法和 B病毒為抗原的EL ISA法,檢測結(jié)果的符合率為 97.4%;在 HSV-1為抗原的 E IA檢測確定的 779份陰性血清中,經(jīng) B病毒抗原的 EL ISA檢測,有 2.6%(20)為陽性; HSV-1為抗原的 E IA和 HSV-1為抗原 EL ISA檢測均為陰性 20份血清樣本,經(jīng) B病毒抗原的 EL ISA檢測,18份仍為檢出陰性,2份為陽性。檢測結(jié)果的符合率為 90%。作者用HSV-1E IA方法檢測的四批共 464份陰性血清樣本經(jīng)日本公司用BV為抗原的EL ISA試劑盒檢測 464份陰性血清中 443份仍為陰性,21份為陽性。符合率為 95.5%。總體看檢測結(jié)果大部分是相同的,但可看出,相同的血清樣本、不同的抗原、不同的方法、不同的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果有一定差異,可能是各實(shí)驗(yàn)室自行制備的 HSV-1抗原片及制定的檢測條件有差異。

作者用 HSV-1作抗原的玻片免疫酶法(E IA)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群進(jìn)行初篩后將陰性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供給不同國家的用戶,據(jù) 2003年以前不完全統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)有七批次 588只,經(jīng)用戶進(jìn)行符合檢測,結(jié)果均得到認(rèn)可?？梢哉f明用人單純皰疹病毒(HSV-1)抗原代替以B病毒(BV)抗原建立的方法對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行初篩是有效的、可靠的。

隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)科的發(fā)展與人們的社會(huì)需求,必須清醒地認(rèn)識(shí)到:由于 B病毒對人的危害性極大,因此實(shí)驗(yàn)用獼猴的 B病毒檢測工作越來越重要,建立無 B病毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群勢在必行。在人工飼養(yǎng)的條件下,用 HSV-1作抗原的玻片免疫酶法(E IA)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群進(jìn)行初篩,以建立無 B病毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群是有較好的積極作用。但是由于方法之間存在差異;HSV-1與B病毒在抗原上客觀存在的差異;各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測條件存在差異,所以存在漏檢的情況。所以,要建立無 B病毒的 SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群建議先用 HSV-1E IA法進(jìn)行 30 d、90 d、180 d反復(fù)檢測,每次檢測出的陽性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都將其及時(shí)隔離,初步建立陰性群,再用 B病毒抗原的方法進(jìn)行確認(rèn)。以后每年進(jìn)行定期的復(fù)檢,隔離陽性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。與此同時(shí),加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,對陰性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群必須建專屬隔離飼養(yǎng)區(qū)、專人負(fù)責(zé),飼養(yǎng)工具、清潔衛(wèi)生工具專用,嚴(yán)格的消毒措施,保證年檢陽性率低于 5%。因此,HSV-1作抗原的玻片免疫酶法(E IA)用在建立無 B病毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群工作上,不但可以提高效率,而且因其應(yīng)用價(jià)廉,頻率高,其降低成本效果更顯著。

[1] Benjamin J,Weigler BJ.Biology of B virus in Macaque and human hosts:A Review[J].ClinInfect Dis,1992,14(2):555 -567.

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[3] 藺會(huì)云,遇秀玲,田克恭.猴 B病毒研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理,2000,17(2):38-44.

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[7] 王曉明,邵偉娟,王建飛.猴 B病毒抗體及 B病毒相關(guān)抗體EL ISA檢測結(jié)果比較 [J].上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),1997,17 (2):80.

[8] 周亞敏,李紹東,楊森富,等.猴皰疹病毒(B病毒)抗體檢測方法的比較研究 [J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2005,15(4)237 -239.

Comparison of ThreeM ethods for Detecting B Virus Antibodies in Macaque M onkey

YANGLi-fen,ZHOU Ya-min,L I Shao-dong,TANG Pin-chao,WU Zhi-lei,WANGQiong
(Yunnan Nation Laboratory Primate Center of China,Kunming 650216,China)

ObjectiveTo compare three detections for B virus antibodies,and to find an accurate,reliable and economicalmethod。MethodsB virus antibodieswere detected with enzyme immunoassay(E IA,HSV-1 antigen),enzyme immunoassay(E IA,B virus antigen)and enzyme-linked immunosorbent assay(EL ISA,B virus antigen)in macaque sera, and the testing resultswere compared。ResultsConsistency of testing results of E IA(HSV-1 antigen)with E IA(B virus antigen)and EL ISA(B virus antigen)were 97.7%and 95.5%。ConclusionThere ismuch consistencyof testing results of E IA(HSV-1 antigen)with E IA(B virus antigen)and EL ISA(B virus antigen),it can be used to do primary detection, and itwill be reduced the cost.

Macaque;B virus;Antibody detection

Q959.848

B

1671-7856(2010)03-0061-03

2009-11-11

楊麗芬(1964-),女,中職,研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail:okylf@163.com