陸廷鳳，于紅

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇南京 210009)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic－ischemic encephalopathy，HIE)是圍產(chǎn)期缺氧、窒息導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損害，臨床出現(xiàn)一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)的疾病，是引起新生兒死亡的主要原因之一，也是引起嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥狀的重要原因。各家報(bào)道HIE的死亡率和致殘率仍為10%～30%。范曉梅［1］在對(duì)12 000名活產(chǎn)兒進(jìn)行調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，HIE的發(fā)病率為1%，其中以胎兒窘迫為主要病因，占HIE發(fā)病的91.7%。大腦被剝奪氧和葡萄糖后可引起神經(jīng)元損傷和死亡，當(dāng)神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞處在發(fā)育時(shí)期，這種損傷就更為嚴(yán)重［2］。催產(chǎn)素(oxytocin，OT)是一種古老的內(nèi)分泌激素，早期對(duì)OT的研究多側(cè)重于其在分娩發(fā)動(dòng)、乳汁分泌等方面的作用，近年來學(xué)者逐漸重視OT與神經(jīng)精神系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)性研究。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道OT對(duì)孕晚期胎鼠海馬缺氧無糖損傷(oxygen and glucose deprivation，OGD)有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與γ－氨基丁酸(GABA)有關(guān)［3］。現(xiàn)進(jìn)一步圍繞OT對(duì)OGD胎鼠海馬催產(chǎn)素受體(oxytocin receptor，OTR)、γ－氨基丁酸 A 受體 β1 亞基(gamma－amimobutyric acid receptor A β1 subunit，GABAAR β1)表達(dá)的影響，探討OT在胎兒神經(jīng)保護(hù)方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕齡20 d SD大鼠4只，體重500～800 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場提供。

1.1.2 試劑及器材 人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol·L－1)［4］:葡萄糖 10.0、NaCl 120.0、KCl 3.33、NaH2PO41.25、MgSO42.4、NaHCO326.0、CaCl22.5;通入 95%O2+5%CO2混合氣體至少30 min達(dá)到飽和，流量約為200 ml·min－1，HCl調(diào)至 pH 7.35 ～7.45。缺氧無糖人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid/oxygen and glucose deprivation，ACSF/OGD):將混合氣體95%O2+5%CO2換為95%N2+5%CO2，并且將ACSF中的葡萄糖換為同濃度的蔗糖。OT(上海第一生化藥業(yè))，OTR兔抗大鼠多克隆抗體(武漢博士德)，GABAAR β1兔抗大鼠多克隆抗體(Bioworld公司);SP免疫組化試劑盒(北京四正柏生物公司);數(shù)顯恒流泵(上海滬西分析儀器廠);混合氣體95%O2+5%CO2、95%N2+5%CO2(南京特種氣體)。

1.2 方法

1.2.1 離體海馬腦片制備 孕鼠乙醚吸入麻醉，2%碘酒及75%乙醇消毒腹部剖腹取出胚胎，剝除胎盤完全暴露胎鼠，斷頭取腦后置于0～4℃ACSF中降溫1 min。用刀片冠狀面切割全腦制作1～2 mm腦片，保留包含海馬的腦片，共得包括海馬區(qū)腦片40片。將腦片轉(zhuǎn)移至溫度為(32.0±0.5)℃的ACSF中，不斷通入95%O2+5%CO2混合氣體，流量為 200 ml·min－1，孵育2～3 h備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥方法 實(shí)驗(yàn)用海馬腦片共40片，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各20片。對(duì)照組用正常ACSF孵育2 h，待其充分作用后通入 ACSF/OGD，行OGD 15 min。實(shí)驗(yàn)組則將正常 ACSF換成含10－6mmol·L－1OT的ACSF孵育，余同對(duì)照組。

1.2.3 評(píng)價(jià)

1.2.3.1 蘇木素－伊紅染色 海馬腦片經(jīng)4%甲醛固定后，24 h內(nèi)常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅染色制片。切片光學(xué)顯微鏡40×10倍視野下觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元排列、細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞核情況。

1.2.3.2 SP免疫組化法半定量檢測(cè)海馬腦片CA1區(qū)OTR、GABAAR β1表達(dá) 具體操作按照試劑盒說明書。SP法即鏈霉素抗生素蛋白－過氧化物酶連接法。石蠟切片依次經(jīng)過二甲苯脫蠟、抗原修復(fù)后，行一抗+生物素標(biāo)記二抗+辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素+辣根酶底物DAB顯色。免疫組化染色陽性反應(yīng)為細(xì)胞膜呈黃棕色。每張切片光鏡20×10倍下定位海馬CA1區(qū)，然后40×10倍下用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量CA1區(qū)陽性細(xì)胞的平均光密度值，分析OTR、GABAAR β1 的表達(dá)。

1.2.3.3 透射電鏡觀察 每組胎鼠各取2只，斷頭后立即取大鼠左側(cè)海馬組織2 mm×2 mm×5 mm，固定于3%戊二醛，1%鋨酸雙固定，Epon812樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾－檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察。電鏡下觀察神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用組間t檢驗(yàn)及方差分析作統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 蘇木素－伊紅染色結(jié)果比較

光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，胞漿呈淡紅色。實(shí)驗(yàn)組腦片中可見海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞呈多層排列，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列較整齊緊密、分布亦較均勻，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多、外形規(guī)則，細(xì)胞層可分3～5層，胞核圓形或橢圓形，染色較淡，染色質(zhì)均勻，偶見核深染或固縮，核膜邊界清晰，核仁圓且明顯。對(duì)照組腦片中可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次變少，數(shù)量減少，排列紊亂、稀疏。部分神經(jīng)細(xì)胞核深染、固縮，核仁不明顯，細(xì)胞周圍間隙增大。見圖1、2。

圖1 對(duì)照組錐體細(xì)胞形態(tài) HE×400Fig 1 Morphology of cell in control group by HE staining×400

圖2 實(shí)驗(yàn)組錐體細(xì)胞形態(tài) HE×400Fig 2 Morphology of cell in experimental group by HE staining ×400

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較

2.2.1 OT對(duì)胎鼠海馬腦片CA1區(qū)OTR表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胎鼠海馬腦片CA1區(qū)OTR免疫組織化學(xué)染色均有陽性反應(yīng)，分別行平均光密度值測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組OTR表達(dá)的平均光密度值為(0.172±0.017)，與對(duì)照組(0.152 ±0.024)比較顯著升高(P=0.048 ＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 海馬腦片CA1區(qū)OTR表達(dá)平均光密度值比較Tab 1 Comparison of integrated option density of OTR expression in CA1 areas of hippocampus

2.2.2 OT 對(duì)胎鼠海馬腦片 CA1 區(qū) GABAAR β1 表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胎鼠海馬腦片CA1區(qū)GABAAR β1免疫組織化學(xué)染色均有陽性反應(yīng)，分別行平均光密度值測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組GABAARβ1表達(dá)的平均光密度值為(0.142 ±0.018)，與對(duì)照組(0.124 ±0.020)比較顯著升高(P=0.036 ＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 海馬腦片CA1區(qū)GABAAR β1表達(dá)平均光密度值比較Tab 2 Comparison of integrated option density of GABAAR β1 expression in CA1 areas of hippocampus

2.3 電鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷情況

對(duì)照組大量神經(jīng)元受損、變性、壞死，核固縮或碎裂，部分核膜溶解，染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀凝集，核仁碎裂，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器明顯減少導(dǎo)致電子密度變低。其中細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)改變見圖3。

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體均較對(duì)照組有所改善，核膜較光滑，染色質(zhì)細(xì)小而分散，胞漿腫脹較對(duì)照組減輕，可見較多的細(xì)胞器。亦可見核膜皺褶內(nèi)陷，核固縮，染色質(zhì)凝集、邊集等凋亡現(xiàn)象。其中細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)改變見圖4。

圖3 對(duì)照組海馬細(xì)胞電鏡下超微結(jié)構(gòu)Fig 3 Ultralstructure of hippocampal cells in control group by transmission electron microscopy

圖4 實(shí)驗(yàn)組海馬細(xì)胞電鏡下超微結(jié)構(gòu)Fig 4 Ultralstructure of hippocampal cells in experimental group by transmission electron microscopy

3 討 論

胚胎中晚期及出生早期是海馬神經(jīng)元發(fā)育成熟的關(guān)鍵時(shí)期，海馬結(jié)構(gòu)中錐體細(xì)胞的產(chǎn)生、遷移、定位等均于胚胎時(shí)期完成。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)氧具有高敏感性，發(fā)育中的神經(jīng)元對(duì)氧的需求較高。分娩過程對(duì)胎腦來說是具有高損傷風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)激性事件，而這種應(yīng)激主要來自產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)宮縮形成的相對(duì)缺氧狀態(tài)。因此，離體狀態(tài)下研究OT對(duì)孕晚期胎鼠海馬OGD是否有神經(jīng)保護(hù)作用及作用機(jī)制具有重要意義。

3.1 OT及OTR系統(tǒng)

OT為9個(gè)氨基酸組成的多肽，在哺乳、分娩、應(yīng)激等刺激下釋放入血液循環(huán)。OTR是經(jīng)典G蛋白偶聯(lián)受體，當(dāng)OT與OTR胞外區(qū)結(jié)合后，活化胞內(nèi)區(qū)Gq亞單位后激活磷脂酶C－β進(jìn)而產(chǎn)生一系列的生理功能［5］。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)OT預(yù)處理的胎鼠海馬腦片經(jīng)OGD后，CA1區(qū)OTR較對(duì)照組顯著升高，上調(diào)了OTR在細(xì)胞膜上的表達(dá)。

3.2 GABA及GABAR系統(tǒng)

在成熟的大腦中GABA是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA 通過與其受體(gamma－aminobutyric acid receptor，GABAR)結(jié)合而發(fā)揮作用。GABAAR在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，主要介導(dǎo)突觸后抑制效應(yīng)，其中β1亞基是受體主要激活位點(diǎn)。在未成熟神經(jīng)元，GABA是主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)胎兒期和新生兒期神經(jīng)元發(fā)育至關(guān)重要。當(dāng)GABA與GABAAR結(jié)合，配體門控氯離子通道開放，神經(jīng)元胞膜對(duì)Cl－通透性增加，Cl－流出神經(jīng)元，神經(jīng)元產(chǎn)生去極化效應(yīng)，激活電壓依賴性Ca2+通道，從而使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，對(duì)神經(jīng)元的生長和分化發(fā)揮重要作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)分娩時(shí)主要來源于母體下丘腦的OT通過胎盤屏障和胎兒血腦屏障到達(dá)胎兒大腦［7］，通過降低氯離子內(nèi)向協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+－K+－2Cl－cotransporter 1，NKCC1)的活性以減少Cl－的內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)，使得神經(jīng)元內(nèi) Cl－濃度下降［8］。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)OT預(yù)處理的胎鼠海馬腦片經(jīng)OGD后，CA1區(qū)GABAAR β1較對(duì)照組顯著升高，上調(diào)了GABAARβ1在細(xì)胞膜上的表達(dá)。當(dāng)GABA作用于GABAAR時(shí)，配體門控Cl－通道開放增加，Cl－順濃度差內(nèi)流增加，GABA效應(yīng)由興奮性向抑制性轉(zhuǎn)化。

3.3 OT 與 OTR、GABAAR β1 關(guān)系

缺血缺氧可直接導(dǎo)致海馬細(xì)胞損傷、能量衰竭。腦血流和氧運(yùn)輸?shù)臏p少啟動(dòng)潛在有害生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括葡萄糖氧化磷酸化中斷，細(xì)胞內(nèi)ATP迅速耗竭，乳酸堆積、細(xì)胞膜去極化、興奮性氨基酸釋放以及細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+、水、自由基堆積，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性水腫和細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)海馬腦片石蠟切片HE染色、電鏡結(jié)果均提示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的變性壞死明顯減少，OT對(duì)海馬神經(jīng)元起保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，經(jīng)OT預(yù)處理的胎鼠海馬腦片 OGD后與對(duì)照組比較，OT顯著上調(diào) OTR、GABAAR β1表達(dá)。OT可能通過一系列的下游機(jī)制抑制NKCC1活性，降低神經(jīng)元內(nèi)Cl－濃度，Cl－順濃度差內(nèi)流增加，當(dāng)GABA與GABAAR結(jié)合時(shí)，配體門控Cl－通道開放增加，GABA效應(yīng)由興奮性向抑制性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致神經(jīng)元去極化抑制，減少神經(jīng)元的耗氧量，從而增強(qiáng)大腦耐受缺氧損傷的能力，減輕分娩中缺氧和低血糖等傷害事件對(duì)胎兒大腦的損傷，實(shí)現(xiàn)對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。

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