胡方方，周家華

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院肝膽外科，江蘇南京 210009)

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤，而胰腺癌肝臟轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胰腺癌治療失敗的主要原因之一［1］，腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)高度有序的、非隨機(jī)的、器官特異性的過(guò)程。近來(lái)研究顯示，腫瘤細(xì)胞可分泌一些可溶性蛋白誘導(dǎo)一群非腫瘤性的骨髓前體細(xì)胞，動(dòng)員并植入遠(yuǎn)處特定的器官組織形成“預(yù)轉(zhuǎn)移的小生境(the pre－metastatic niche)”，從而招募循環(huán)腫瘤細(xì)胞至特定的位點(diǎn)形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而腫瘤細(xì)胞分泌的特定蛋白質(zhì)在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用，它們決定著腫瘤轉(zhuǎn)移器官分布的特異性［2－3］。因此，篩選及鑒定與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)對(duì)于闡明胰腺癌定向肝轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找胰腺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷、預(yù)后判斷及藥物治療新靶點(diǎn)均具有重要意義。

本研究采用蛋白組學(xué)技術(shù)，分析比較一對(duì)來(lái)自同一親本、具有不同肝轉(zhuǎn)移潛能的胰腺癌細(xì)胞株分泌蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，以期篩選出與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)，為尋找早期診斷胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為闡明胰腺癌定向肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞及分子機(jī)制提供初步理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人高肝轉(zhuǎn)移潛能胰腺癌細(xì)胞株L3.6 pl由美國(guó)德州大學(xué)安德森腫瘤中心提供，人低肝轉(zhuǎn)移潛能胰腺癌細(xì)胞株Colo－357由本實(shí)驗(yàn)室保存，前者為后者經(jīng)裸鼠活體內(nèi)連續(xù)篩選六輪獲得［4］，二者具有完全相同的遺傳背景。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶系Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清系杭州四季青公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒系碧云天公司產(chǎn)品;固相化pH梯度干膠條(IPG strip，24 cm，pH 3 ～10)、IPG 緩沖液(pH 3 ～10)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、尿素(Urea)、CHAPS、過(guò)硫酸銨、碘乙酰氨(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)均系通用公司產(chǎn)品;硝酸銀、溴酚藍(lán)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、硫代硫酸鈉、甘油、EDTA、無(wú)水碳酸鈉、冰醋酸均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶、鐵氰化鉀、三氟乙酸(TFA)、碳酸氫銨、乙腈(CAN)和基質(zhì)α－氰基－4－羥基肉桂酸(CCA)為Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器及生物信息學(xué)軟件 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱系Espec公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡系日本Olympus公司產(chǎn)品;IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALTⅢ垂直電泳槽、Image scanner掃描儀、Image master凝膠圖像分析軟件系 Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品;超濾離心管(截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000)系德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品;MALDI－TOF－MS 質(zhì)譜儀、Data Explorer質(zhì)譜分析軟件系A(chǔ)pplied Biosystem公司產(chǎn)品;Mascot肽質(zhì)量指紋圖數(shù)據(jù)庫(kù)查詢軟件系Matrixscience公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)L3.6 pl和 Colo－357細(xì)胞至80%左右融合，棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液輕柔洗滌5遍后加入無(wú)血清、無(wú)酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的提取 收集兩種細(xì)胞的培養(yǎng)上清，于4℃下分別以1 000×g、3 000×g離心以去除殘留細(xì)胞，吸取上清，利用直徑0.45 μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾以進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片，再使用分子截留量為10 000的超濾離心管對(duì)培養(yǎng)上清于4℃、5 000×g離心6 h行超濾處理，反復(fù)重復(fù)3次，以濃縮蛋白樣品并除鹽。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，蛋白樣品分裝后于－80℃凍存。

1.2.3 分泌蛋白質(zhì)的雙向電泳 將24 cm固相化pH梯度干膠條置于溶脹盤內(nèi)水化過(guò)夜，將水化充分的IPG膠條轉(zhuǎn)移至通用型杯上樣膠條槽，將濃縮除鹽后的蛋白樣品(200 μg)經(jīng)上樣杯方式加至IPG膠條內(nèi)，使用IPGphor等電聚焦儀進(jìn)行第一向等電聚焦，參數(shù)設(shè)置為:(1)低電壓水化，30 V 6 h，60 V 6 h;(2)升壓，500 V 1 h step，1 000 V 1 h step;(3)梯度除鹽，3 000 V 3 h gradient，8 000 V 3 h gradient;(4)等電聚焦，8 000 V step 8～10 h。待24 cm膠條等電聚焦達(dá)到80 000 Vh時(shí)，結(jié)束第一向等電聚焦。等電聚焦結(jié)束后將IPG膠條依次于10 ml平衡液Ⅰ(50 mmol·L－1pH 8.8 的Tris－HCl，6 mmol·L－1尿素，30% 甘油，2%SDS，痕量溴酚藍(lán)，1%DTT)和 10 ml平衡液Ⅱ(50 mmol·L－1tris－HCl，pH 8.8，6 mmol·L－1尿素，30%甘油，2%SDS，痕量溴酚藍(lán)，3%碘乙酰氨)中平衡15 min。平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至12.5%SDS－PAGE膠上端，在Ettan DALTⅢ垂直電泳槽上進(jìn)行第二向垂直電泳。參數(shù)設(shè)置為 P1 2 W·膠－1，30 min;P2 5 W·膠－130 min;P3 15 W·膠－16 h。在溴酚蘭前緣運(yùn)行到凝膠底部邊緣時(shí)，終止電泳。剝離取下凝膠，將凝膠在固定液(無(wú)水乙醇100 ml、無(wú)水冰醋酸25 ml)中固定30 min，然后在敏化液作用30 min，蒸餾水漂洗后加入銀染液［硝酸銀1.25 g·(500 ml)－1，37%甲醛100 μl］中染色20 min，漂洗，顯色3～5 min，終止顯影10 min。

1.2.4 凝膠圖像掃描及分析 銀染顯色后的凝膠用Image scanner TM掃描儀進(jìn)行透射掃描，獲得的數(shù)字化圖像運(yùn)用ImageMasterR 2D Elite(Version 2.00)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)、量化、背景扣除、點(diǎn)的匹配(Match)。在兩組圖譜中蛋白質(zhì)的表達(dá)量相差兩倍的點(diǎn)被視為有差異的點(diǎn)，隨機(jī)選取重復(fù)性和分辨率較高的10個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜分析鑒定。

1.2.5 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析 從凝膠中挖取差異蛋白點(diǎn)，50%乙腈和50 mmol·L－1碳酸氫氨脫色30 min，脫水冷凍抽干，再加入5 ng·μl－1序列修飾后胰酶，4℃放置30 min，加入25 mmol·L－1碳酸氫氨7.5 μl，37 ℃放置12 h，加入0.35 μl 2%TFA終止酶解反應(yīng)。將樣品和基質(zhì)按1∶1等體積混合后吸取1 μl點(diǎn)樣于點(diǎn)樣靶上，干燥晾干后行MALDI－TOF－MS鑒定分析，在延遲解吸和反射模式下進(jìn)行譜圖采集，激光波長(zhǎng)337 nm，加速電壓設(shè)置19 kV。每一個(gè)肽譜圖大約是由200次轟擊壘加而成，外標(biāo)采用布魯克公司肽混合物標(biāo)準(zhǔn)品，內(nèi)標(biāo)采用胰蛋白酶的自切峰，分別為 m/z 842.50和 m/z 2211.10，最終獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。

1.2.6 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 將PMF結(jié)果利用Mascot搜索引擎檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，將實(shí)驗(yàn)得到的PMF和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中理論的PMF加以比較即可鑒定蛋白質(zhì)。檢索條件:蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇SwissProt庫(kù)，物種來(lái)源選擇人類，酶選擇Trypsin，允許不完全的酶解片段選擇為1個(gè)，肽片段分子量最大允許誤差為50 ppm，離子選擇為MH+。

2 結(jié) 果

2.1 雙向凝膠電泳結(jié)果

在相同條件下對(duì)L3.6 pl細(xì)胞和Colo－357細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)分別進(jìn)行了3次雙向凝膠電泳分離，硝酸銀染色顯色后得到2－DE圖譜各3張，兩株細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的圖譜分布模式非常相似。經(jīng)Image masterR 2D Elite(Version 2.00)軟件分析，L3.6 pl細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的3張凝膠平均檢測(cè)到(840±20)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，Colo－357細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的3張凝膠平均檢測(cè)到(860±25)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，兩組凝膠的匹配率為92%，將其中一塊凝膠設(shè)定為參考膠，進(jìn)行3塊膠間的匹配分析得到平均匹配率分別為85.5%和88.6%。L3.6 pl和Colo－357細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)表達(dá)變化差異大于2倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)共20個(gè)，其中在L3.6 pl中上調(diào)表達(dá)蛋白11個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白9個(gè)。由此，本實(shí)驗(yàn)獲得了重復(fù)性、對(duì)比性均較好的L3.6 pl細(xì)胞和Colo－357細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)的2－DE圖譜。見圖1、2。

圖1 人胰腺癌細(xì)胞L3.6 pl和Colo-357分泌蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜(圖中數(shù)字標(biāo)識(shí)的是兩株細(xì)胞間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn))Fig 1 Representative 2-DE map of secretome of pancreatic cell lines L3.6 pl and Colo-357(the differentially expressed protein spots between L3.6 pl and Colo-357 were labelled with figures)

圖2 部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的局部放大圖Fig 2 Close-up image of partial differential expression protein spots between L3.6 pl and Colo-357 spot1 and spot2 were significantly higher in L3.6 pl than those in Colo－357，and spot4 was significantly lower in L3.6 pl than that in Colo－357

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

從2－DE膠中挑選背景清晰、分辨率和重復(fù)性較好的10 個(gè)差異蛋白點(diǎn)(1、2、3、4、5、6、7、8、9、13、20 號(hào)點(diǎn))，行MALDI－TOF－MS鑒定分析，本研究共成功鑒定出其中5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，分別為:1號(hào)點(diǎn)，組織蛋白酶D前體(Cathepsin D precursor);2號(hào)點(diǎn)，表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(epidermal－Fatty acid－binding protein，E－FABP);4 號(hào)點(diǎn)，視黃醛脫氫酶1(retinal dehydrogenase 1);5號(hào)點(diǎn)，二磷酸核苷激酶B(nucleoside diphosphate kinase B);6號(hào)點(diǎn)，膜連蛋白A1(annexin A1)。其中，組織蛋白酶D前體、表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白在高肝轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株L3.6 pl中的表達(dá)水平高于低肝轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株Colo－357，而視黃醛脫氫酶1、二磷酸核苷激酶B、膜連蛋白A1在L3.6 pl細(xì)胞株中的表達(dá)水平低于Colo－357細(xì)胞株。1號(hào)蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果見圖3，得到鑒定的5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在雙向凝膠上的位置和具體信息分別見圖1和表1。

圖3 1號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果Fig 3 MALDI-TOF-MS analysis of protein spot 1 A.Peptide mass fingerprinting of protein spot 1;B.Database query results of spot 1，which was identified as Cathepsin D precursor with a Mascot score of 136

表1 質(zhì)譜鑒定的L3.6 pl和Colo-357細(xì)胞的差異分泌蛋白質(zhì)Tab 1 List of differentially expressed secretory protein spots of pancreatic cell lines L3.6 pl and Colo-357 identified by MALDI-TOF-MS

3 討 論

分泌蛋白質(zhì)可通過(guò)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、能量代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附及遷移、基質(zhì)降解、血管生成等環(huán)節(jié)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究采用比較蛋白組學(xué)的研究方法，對(duì)一對(duì)來(lái)自同一親本、具有不同肝轉(zhuǎn)移潛能的人胰腺癌細(xì)胞株L3.6 pl和Colo－357的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、比較、篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者之間有20種分泌蛋白質(zhì)的表達(dá)水平發(fā)生了明顯改變，提示這些差異表達(dá)的分泌蛋白質(zhì)可能與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，胰腺癌肝侵襲轉(zhuǎn)移的特性可能是眾多蛋白共同作用的結(jié)果。本研究最終鑒定出其中5種與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)，分別為組織蛋白酶D前體、表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白、視黃醛脫氫酶1、二磷酸核苷激酶B、膜連蛋白A1。通過(guò)參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)信息及檢索相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，此5種候選差異蛋白質(zhì)可能通過(guò)調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、黏附、運(yùn)動(dòng)、凋亡等功能來(lái)影響胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的病理進(jìn)程。

組織蛋白酶D是一種天門冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶，其可以多種形式存在，分泌時(shí)為52 kU酶原，可自身降解為兩條肽鏈組成的48 kU活性分子中間體，中間體進(jìn)一步加工修飾為34 kU及14 kU的肽鏈片段為其成熟形式。組織蛋白酶D在惡性腫瘤中的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，并激活其他組織蛋白酶B(CB)及膠原酶，繼而觸發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并最終促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［5］。組織蛋白酶D在某些腫瘤細(xì)胞中以無(wú)活性的前體形式存在。研究結(jié)果表明，這些無(wú)活性的前體在包括乳腺癌在內(nèi)的許多腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5－8］，在本研究中組織蛋白酶D前體在高肝轉(zhuǎn)移潛能胰腺癌細(xì)胞株L3.6 pl中上調(diào)表達(dá)，提示組織蛋白酶D前體可能與胰腺癌肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

E－FABP屬于脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員，是一種對(duì)脂肪酸有高親和力的小分子量的可溶性蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中，主要在脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)EFABP在胰腺癌［9］和結(jié)腸癌［10］的耐藥細(xì)胞株中均呈過(guò)度表達(dá)，提示其可能與腫瘤的生長(zhǎng)密切相關(guān)。進(jìn)一步研究證實(shí)，E－FABP是癌基因c－myc的靶基因，并可被腫瘤相關(guān)抗原EpCAM誘導(dǎo)后快速上調(diào)表達(dá)［11］，c－myc和EpCAM可能作為E－FABP的上游因子，在特定階段開啟和關(guān)閉E－FABP的表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。然而，目前對(duì)E－FABP在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，E－FABP在高肝轉(zhuǎn)移潛能胰腺癌細(xì)胞株L3.6 pl分泌蛋白質(zhì)中呈顯著上調(diào)表達(dá)，提示其可能促進(jìn)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移，而Uma等［12］研究表明舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能與其E－FABP的表達(dá)水平則呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。關(guān)于E－FABP在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步探討研究。

二磷酸核苷激酶B是nm23基因編碼的產(chǎn)物，nm23基因家族是一類與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移起抑制作用，其主要通過(guò)參與微觀蛋白的聚合和調(diào)節(jié)G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳遞，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的負(fù)性調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［13］，本研究發(fā)現(xiàn)二磷酸核苷激酶B在高肝轉(zhuǎn)移L3.6 pl細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)中的表達(dá)水平顯著低于低肝轉(zhuǎn)移Colo－357細(xì)胞，提示二磷酸核苷激酶B可能作為胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的負(fù)性調(diào)節(jié)因子發(fā)揮抑制胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的作用。

本研究將雙向凝膠電泳、質(zhì)譜分析等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)引入胰腺癌定向肝轉(zhuǎn)移方面的研究中，篩選出了部分胰腺癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)分泌蛋白，這些蛋白涉及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、黏附、運(yùn)動(dòng)、凋亡等功能相關(guān)事件，但由于蛋白組學(xué)技術(shù)本身存在的局限性，本研究結(jié)果尚需進(jìn)一步的驗(yàn)證，以證實(shí)這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移中的作用。

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