孔立紅 周紅娟 葉煜婉 杜艷軍 崔常香 周 華

穴位埋藥線與穴位注射對腦缺血大鼠皮質(zhì)區(qū)MMP－9影響及比較觀察＊

孔立紅 周紅娟 葉煜婉 杜艷軍 崔常香 周 華

目的觀察局灶性腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)區(qū)組織基質(zhì)金屬蛋白酶－9(MMP－9)的表達(dá)及川芎嗪緩釋劑穴位埋藥線和川芎嗪穴位注射干預(yù)對其的影響。方法將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組(1d組、3d組、5d組)、穴位注射組(1d組、3d組、5d組)、穴位埋藥線組(1d組、3d組、5d組)、尾靜脈注射組(1d組、3d組、5d組)。采用改良線栓法制備局灶性腦缺血(MCAO)再灌模型。穴位埋藥線組在大椎、百會穴埋入膠原川芎嗪緩釋劑藥線;穴位注射組在大椎、百會穴注射川芎嗪注射液;運(yùn)用蛋白免疫印跡法檢測缺血側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)組織MMP－9蛋白的表達(dá)和含量。結(jié)果穴位埋藥線組與穴位注射組能明顯下調(diào)缺血側(cè)腦皮質(zhì)中MMP－9的表達(dá)和含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中穴位埋藥線組的下調(diào)作用最明顯，與穴位注射組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論穴位埋藥線可下調(diào)腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)組織MMP－9的表達(dá)，進(jìn)而可能減少腦微血管基底膜的降解，保護(hù)微血管的完整性，減少腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注 穴位埋藥線 百會 大椎 基質(zhì)金屬蛋白酶－9

湖北中醫(yī)藥大學(xué)(武漢430061)

＊國家中醫(yī)藥管理局基金資助項目(No.06－07JP27)

腦微血管通透性的改變是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要原因之一，其通透性的改變與微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和微血管基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)密切相關(guān)，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在這一過程中起著主要作用。已有研究表明[1]，腦缺血時MMPs表達(dá)增加，可降解血管基底膜，破壞腦微血管的完整性，加重腦缺血再灌注損傷。因此，筆者采用膠原川芎嗪制備緩釋劑(藥線)，植入大椎、百會穴，觀察腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)組織MMP－9的含量變化，并與穴位注射和靜脈注射相比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年SD大鼠，共72只，雌雄不限，體質(zhì)量(200±20)g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物編號:醫(yī)動字第19－069號。于實(shí)驗(yàn)前1周購進(jìn)，飼養(yǎng)于安靜、溫暖且避強(qiáng)光的環(huán)境中，室溫(22±2)℃，自由飲水飲食。

1.2 試藥及儀器 采用酸溶解法從大鼠鼠尾肌腱提取膠原蛋白[2]，和川芎嗪注射液 (北京市永康藥業(yè)有限公司，規(guī)格2mL:40mg)按照一定比例制成藥線，長約2m，藥物含量為0.2mg，常溫干燥，紫外照射消毒，備用。Western blotting檢測試劑(中杉金橋生物有限公司);10%水合氯醛、生理鹽水、多聚甲醛購于武漢化學(xué)試劑公司。電熱燒灼器(上海醫(yī)療器械廠);無菌醫(yī)用縫合尼龍線(上海醫(yī)用縫合針廠);TS400D型電子天平(Ohaus，USA);MiliQ純水凈化儀(MiliQ，USA)。

1.3 模型制備 選擇直徑為0.25～0.28mm單股縫合尼龍線，長50mm，將插入端加熱熔化，使之成為光滑球面，直徑約0.30mm，用酒精清潔后置于生理鹽水中備用。局灶性腦缺血(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌模型的建立采用改良線栓法[3]。大鼠造模前禁食不禁水24h，稱重后以10%水合氯醛(0.3mL/100g)進(jìn)行腹腔麻醉并保溫。麻醉大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，常規(guī)皮膚消毒后，頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)，分離出頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)。電凝ECA入腦分支，結(jié)扎游離ECA主干，分離ICA主干至翼腭動脈(PPA)，并在其起始部位置一動脈夾。先將CCA用動脈夾夾住，再在ECA殘端剪0.2mm的小口，將線栓插入。輕推尼龍線尾端經(jīng)CCA分叉部沿ICA入顱，至大腦中動脈(MCA)，遇阻即止。尼龍線插入深度約18mm，30min后，抽取線栓對大鼠進(jìn)行腦缺血再灌注，縫合切口后，用碘酒消毒。動物保溫喂養(yǎng)，注意觀察造模大鼠生理指征。

1.4 模型篩選 采用Zea－longa[4]評分方法，當(dāng)造模大鼠清醒后，即評定動物神經(jīng)功能缺損。0分:正常;1分:對側(cè)肢體屈曲;2分:拖住尾巴后拉時，對側(cè)肢體無力;3分:拖住尾巴后拉時，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;4分:自發(fā)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒;5分:無任何自發(fā)活動。神經(jīng)功能障礙在1分以上的大鼠視為成功模型。

1.5 分組及給藥 將造模成功的大鼠分為模型組、穴位埋藥線組、穴位注射組及尾靜脈注射。每組再按時相分為1、3、5d 3個亞組，每個亞組6只大鼠。

穴位埋藥線組[5]:28號1.5寸針灸針剪去針尖、磨平，穿入7號注射針頭制成埋藥工具。大鼠的百會、大椎穴常規(guī)備皮、消毒，藥物經(jīng)紫外線照射消毒，埋藥針具經(jīng)常規(guī)高溫消毒。將藥線裝入注射針頭，百會、大椎穴埋藥時，直刺3mm，輕推針灸針針柄埋入藥線，然后緩慢退出注射針頭，埋藥處常規(guī)消毒。腦缺血再灌注后1h穴位埋藥1次，以后每天埋藥1次，取材當(dāng)天不埋藥治療。穴位注射組:注射穴位常規(guī)備皮、消毒，用5號注射針頭垂直刺入大椎2mm、向前斜刺入百會2mm，回抽無回血后，緩慢推入川芎嗪注射液，劑量為0.1mL/100g，10s推注完畢。在腦缺血再灌注后1h注射1次，以后每日注射1次，取材當(dāng)天不注射治療。尾靜脈注射組[6]:鼠尾酒精消毒，充分顯露尾靜脈，用5號注射針頭緩慢推注川芎嗪注射液，劑量為33mg/kg。腦缺血再灌注后1h尾靜脈注射1次，以后每天注射1次，取材當(dāng)天不注射治療。

1.6 標(biāo)本采集及檢測 取各組大鼠以10%水合氯醛麻醉，迅速斷頭取腦，在冰盤上迅速剝離皮質(zhì)，切取視交叉前后3mm的部位，放入液氮罐 (－196℃)中速凍后，移至－80℃冰箱中保存。蛋白免疫印跡法[7]測定大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)組織MMP－9蛋白的含量，具體方法嚴(yán)格按照說明書上進(jìn)行操作。運(yùn)用Gel Document Analysis System中Gel base/Gel plot分析軟件對目標(biāo)帶進(jìn)行分析，測出條帶的光密度值，各組MMP－9的含量用其占正常值的百分比表示。

2 結(jié)果

見圖1、表1。假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)組織MMP－9含量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);模型組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)可見明顯MMP－9表達(dá)，模型1d組表達(dá)明顯升高，3d組到達(dá)高峰，5d組有所降低，與其他3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。穴位埋藥線組能明顯下調(diào)MMP－9的表達(dá)，與穴位注射組和尾靜脈注射組相比較均有明顯差異(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠皮質(zhì)MMP－9蛋白的表達(dá)(92kD)

表1 各組大鼠皮質(zhì)組織MMP－9的光密度值(%，±s)

表1 各組大鼠皮質(zhì)組織MMP－9的光密度值(%，±s)

注:與假手術(shù)組比較，■P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01;與穴位埋藥線組比較，＊P ＜ 0.01

1d 5d分 組正常組假手術(shù)組模型組穴位注射組尾靜脈注射組穴位埋藥線組n 6 18 18 18 18 18 0.0131 ± 0.0003 0.0584 ± 0.0036■0.0350 ± 0.0020△＊0.0308 ± 0.0022△0.0249 ± 0.0003△＊3d 0.0131 ± 0.0006 0.0131 ± 0.0008 0.0601 ± 0.0009■0.0383 ± 0.0025△0.0460 ± 0.0085△＊0.0303 ± 0.0009△＊0.0131 ± 0.0009 0.0579 ± 0.0029■0.0347 ± 0.0026△0.0446 ± 0.0022△＊0.0227 ± 0.0006△＊

3 討論

局灶性腦缺血可以引起基底膜結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致微血管出血，腦微血管通透性的改變，從而加重腦缺血再灌注損傷。而基底膜主要由ECM分子構(gòu)成，能維持血管的結(jié)構(gòu)完整?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅－依賴內(nèi)生肽酶[8]，為ECM蛋白水解酶，可降解基底膜的ECM成分，增加血管通透性，促使內(nèi)皮細(xì)胞增生、移行，破壞血管的結(jié)構(gòu)完整，影響新生血管的形成，在腦缺血再灌注損傷的進(jìn)展和恢復(fù)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9－10]。

MMP－9是一種分子量為92kD的糖蛋白，由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌[11]，能夠清除ECM，促進(jìn)反應(yīng)細(xì)胞生長、移行。MMP－9的降解產(chǎn)物能使纖溶酶原水解生成血管他丁，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞毛細(xì)血管完整性，抑制血管新生的作用[12]。在局灶性腦缺血后，MMP－9活化，降解基底膜成分，破壞微血管完整性，損傷血腦屏障，并影響隨后的血管再生[13]。

研究表明川芎嗪有解痙、降低血管阻力和強(qiáng)烈抑制血小板聚集的作用，對已聚集的血小板有解聚作用，能明顯降低全血黏度，治療缺血性腦血管病效果良好[14]。川芎嗪和膠原制成的緩釋劑具有長效作用和恒釋作用[15]。本實(shí)驗(yàn)用膠原川芎嗪藥線，選取督脈的大椎、百會穴位進(jìn)行埋藥線。結(jié)果 表明，模型組各時相大鼠MMP－9含量較正常大鼠及各治療組大鼠顯著升高，提示MMP－9確實(shí)參與了腦缺血再灌注后病理損傷過程，與文獻(xiàn)報道一致[16]。穴位埋藥線組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中MMP－9的含量明顯低于穴位注射組和尾靜脈注射組，并隨時間推移趨于正常水平。穴位埋藥線可能通過降低腦缺血再灌注后MMP－9的表達(dá)，抑制微血管細(xì)胞外基質(zhì)的降解，保護(hù)血管結(jié)構(gòu)的完整性，減少腦缺血再灌注損傷，從而起到腦保護(hù)作用。其作用優(yōu)于其他治療方法，推測穴位埋入膠原川芎嗪緩釋藥線可能發(fā)揮了藥物、穴位雙重作用。這與我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[17－19]。

針刺是臨床常用的治療腦血管疾病的有效方法之一，緩釋劑是近年研究發(fā)展的一種新劑型，具有長效作用和恒釋作用。膠原中藥緩釋劑在穴位埋藥線，是一種新的劑型和特殊的治療方法，具有一定的治療優(yōu)勢及特點(diǎn)。

[1]Berti R， Williams A J， Moffett J R， et al.Quantitative real－time RT－PCR analysis of inflarnmnatory gene expression associated with ischemia－ reperfusion brain injury[J].Cereb Blood Flow Merab，2002，22(9):1068 － 1079.

[2]余海，廖小宜，周志瑜.鼠尾肌腱膠原蛋白的提取與凝膠的制備[J]. 海南醫(yī)學(xué)，2000，11(3):64－65.

[3]孟宜良.線栓法大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血模型研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)學(xué):神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊，2002，2(29):113－115.

[4]Longa EZ，Weinstein PR，Carson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1):84－91.

[5]華興邦，李辭蓉，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制[J].實(shí)驗(yàn)動物與動物實(shí)驗(yàn)，1991，2(1):1 －5.

[6]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:334－335.

[7]Wang S.Ever B M.Cytokine－mediated differential induction of hepatic activator protein －1 genes[J].Surgery，1998，123(2):191 － 198.

[8]Roeb E，Matern S.Matrix metalloproteinases and colorectal cancer[J].Med Klin(Munich)，2003，98(4):763 － 770.

[9]Diaz Gil JJ，Gareia Monzon C，Rúa C，et al.The Anti－ fibrotic effect of liver growth factor is associated with decreased intrahepatic levels of matrix metalloproteinases 2 and 9 and transforming growth factor beta 1 in bile duct－ligated rats[J].Histol Histopathol， 2008，23(5):583－591.

[10]McCawley LJ，Matrisian LM.Matrix metalloproteinases:they’re not just for matrix anymore[J].Curr Opin Cell Biol，2001，13(5):534 － 540.

[11]袁發(fā)煥，李驚子.細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊，2000，21(2):62－65.

[12]Basile D P， Fredrich K， Weihrauch D， et al.Angiostatin and matrix metalloprotease expression following ischemic acute renal failure[J].Am J Physiol Renal Physiol，2004，286(5):893 － 902.

[13]Rosell A，Ortega－Aznar A，Alvarez－Sabin J，et al.Increased Brain Expression of Matrix Metalloproteinase － 9 after Ischemic and Hemorrhagic Human Stroke[J].Stroke，2006，37(6):1399 － 1406.

[14]徐鴻華.中草藥彩圖手冊(6)[M].廣州:廣東科技出版社，2003:16.

[15]胡瑜蘭，張均壽.植入劑應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)藥:合成藥生化藥制劑分冊，2001，22(1):36 －45.

[16]李福順，閆偉，杜慶娟.川芎嗪對大鼠前腦缺血再灌注后MMP－9的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2007，24(5):598－600.

[17]孔立紅，孫國杰，毛娟娟，等.穴位埋藥和電針對腦缺血再灌注大鼠TNF－α、IL－6含量的影響及比較觀察 [J].針刺研究，2007，32(5):301－305.

[18]孔立紅，毛娟娟，孫國杰，等.穴位埋藥對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響[J].上海針灸雜志，2007，26(7):40－42.

[19]孔立紅，毛娟娟，孫國杰，等.穴位埋藥對腦缺血再灌注大鼠海馬細(xì)胞因子TNF－α含量的影響 [J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2007，2(4):10－12.

Effects of Embedding Medicine in Acupoints and Point Injection on Matrix Metalloproteinase-9 of Cortex Tissues in Rats with Focal Cerebral Ischemia Reperfusion Injury

KONG Li-hong，ZHOU Hong-juan，YE Yu-wan，et al
Hubei University of Chinese Medicine(Wuhan 430061)

Objective:To observe the MMP－9 expression and concerntration in cortex area of rats with cerebral ischemia.And to discuss the effect of embedding medicine in acupoint and point injection with tetramethylpyrazine in this diseaseMethods72 SD rats were randomly divided into the normal group，the sham operation group，the model groups(the 1d group，the 3d gruop and the 5d group)，the acupoint injection group(the 1d group，the 3d gruop and the 5d group)，the embedding medicine in acupoints group(the 1d group，the 3d gruop and the 5d group)and the tail vein injection group(the 1d group，the 3d gruop and the 5d group).The model of cerebral artery occlusion(MCAO)and reperfusion was developed by occluding rat’s right middle cerebral artery following suture occlusion method.After establishing the model successfully，the embedding medicine in acupoints group was implanted into Baihui(GV 20)and Dazhui(GV 14).The injecting medicine in acupoints group was injected into Baihui(GV 20)and Dazhui(GV 14).The content of MMP－9 in cortex tissues was evaluated with western blotting.ResultsThe content and the expression of MMP－9 in cortex tissues of model groups was significantly higher than that of other three groups.The content of MMP－9 in the cortex tissues of the groups of embedding medicine in acupoints，comparing with the groups of injecting medicine into rats’tail veins and of injecting medicine in acupoints， was cut down signifficantly.Comparing the groups of injecting medicine into rats’tail vein and the groups of injecting medicine in acupoints，the expression of MMP－9 of the frontier was less than the laster.ConclusionThe method of embedding medicine in acupoints could inhibit the expression of the MMP－9 in cortex tissues of rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury to protect the brain and decrease the reperfusion injury.

Cerebral ischemia reperfusion;Embedding medicine in acupoint;Baihui(GV 20);Dazhui(GV 14);MMP－9

R285.5

A

1004－745X(2010)10－1718－03

2010－01－10)