牛成偉，曹 凱

（承德醫(yī)學院，河北承德 067000）

血管內(nèi)皮細胞的功能是否正常與保持通暢的血液循環(huán)，維持正常的血管舒縮狀態(tài)密切相關，在病理因素作用下發(fā)生的內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素[1]。采用培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞進行科學研究是一種普遍的實驗方法。本研究旨在建立一種簡單，能夠獲得較多細胞數(shù)目，且活力良好的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，為進一步進行相關研究提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 新生兒臍帶：由承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院提供。

1.1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)基，GIBCO產(chǎn)品；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，澳大利亞；膠原酶Ⅰ，SIGMA公司產(chǎn)品；堿性成纖維生長因子（bFGF），美國E.coli產(chǎn)品；Ⅷ因子相關抗原、通用SP系列試劑盒、DAB顯色試劑盒為中杉金橋生物技術有限公司。完全培養(yǎng)基成分：80% DMEM：20%胎牛血清；bFGF，20ng/ml；青霉素，100U/ml；鏈霉素，0.1g/L。

1.1.3 儀器：HERAcell 150型CO2孵育箱，德國Heraeus公司；LEICA DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡，德國Wetzlar GmbH公司；凈化工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下取新生兒臍帶約25cm，剪去兩端夾痕，擠出殘留血液，PBS沖洗至沖洗液無色。將血管下端夾緊，注入0.1%膠原酶Ⅰ與0.25%胰酶、0.02%EDTA（V/V=1:1）的混合消化酶至靜脈充盈，置37℃溫箱中消化13min。收集消化液于錐形瓶，迅速加2ml小牛血清終止消化；并用D-Hanks液沖洗臍靜脈，將沖洗液一并收集在錐形瓶中，離心10min；棄上清，加入完全培養(yǎng)液5ml，混勻后接種于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。24h更換培養(yǎng)液，以后每隔2d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞達80%以上融合時，加入0.125%胰酶、0.01%EDTA，常溫下消化。鏡下觀察細胞出現(xiàn)皺縮、細胞間隙增寬、細胞變圓，立即加入含血清的培養(yǎng)液滅活，停止消化。用吸管輕輕的吹打，使仍貼壁的細胞脫落，離心。棄上清液，加入2ml完全培養(yǎng)基，制成均勻的細胞懸液，計數(shù)，按密度1.0×105個/ml接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的鑒定：將培養(yǎng)的細胞接種到預先放入多聚賴氨酸包被過的蓋玻片的培養(yǎng)皿內(nèi)，進行細胞爬片，待細胞生長至80%融合時，終止培養(yǎng)。丙酮固定10min，3%H2O2浸泡30min，山羊血清封閉，加入兔抗人Ⅷ因子IgG抗體（一抗）4℃過夜，DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明封片后顯微鏡下觀察。以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應，以PBS液代替一抗作為陰性對照。

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察 原代細胞呈單層生長，邊界清楚，形態(tài)為卵圓形。培養(yǎng)3-4d融合，呈典型的鋪路石狀鑲嵌排列。傳代細胞的形態(tài)和生長特點與原代細胞類似。

2.2 人第Ⅷ因子相關抗原免疫組化檢測 細胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒，胞核為藍色，說明細胞內(nèi)有內(nèi)皮細胞特有的第Ⅷ因子相關抗原存在；對照組為陰性反應。

3 討論

人臍靜脈作為內(nèi)皮細胞的材料來源，具有取材容易、操作方便的特點，且與各種實驗動物相比，其實驗條件更符合人體情況，結果更具有意義。在培養(yǎng)細胞的獲取方法上，有機械刮取、組織塊移植和酶消化法三種。前兩種易混雜其它血管壁細胞，近年已逐漸被酶消化法取代[2]。胰蛋白酶、膠原酶均可用于消化血管內(nèi)皮細胞，但胰蛋白酶對內(nèi)皮細胞的損傷較大；膠原酶作用較溫和，但價格昂貴，限制了其在大規(guī)模實驗研究中的應用。本研究采用胰蛋白酶、膠原酶等比混和消化液對內(nèi)皮細胞進行消化，細胞生長良好。

本研究認為，影響細胞貼壁、生長和融合的因素包括：①臍帶應新鮮，取下后立即放入冷D-Hanks液中，在4h內(nèi)完成內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)，有利于細胞貼壁和生長。②掌握消化酶的濃度和時間非常重要。預實驗時采用膠原酶Ⅰ與胰蛋白酶、EDTA等比混和消化液分別消化8min、13min和18min，發(fā)現(xiàn)消化13min，獲取的內(nèi)皮細胞數(shù)量最多，而成纖維細胞和平滑細肌細胞則較少被消化下來，且內(nèi)皮細胞的生長、增殖狀態(tài)良好。③人臍靜脈內(nèi)皮細胞是一種低增殖能力的細胞，需加入生長刺激因子以促進細胞生長。其它研究者的實驗，多添加血管內(nèi)皮生長因子。血管內(nèi)皮生長因子能專一性的促進內(nèi)皮細胞增殖，但因為價格昂貴，很難推廣應用[3]。本研究加入價格低廉的bFGF。bFGF是一種多效能的細胞生長因子，可促進細胞分裂增殖，增強有絲分裂活性[4]。

綜上所述，本研究的人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離、培養(yǎng)、鑒定的方法簡捷易行，成功率較高，能獲得大量內(nèi)皮細胞，能很好地滿足實驗研究的需要。

[1]Mallika V,Goswami B,Rajappa M.Atherosclerosis pathophysiology and the role of novel risk factors:a clinicobiochemical perspective[J]. Angiology,2007,58（5）:513-522.

[2]王立巖，佟曉紅，宮桂蘭，等.人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)觀察[J].白求恩醫(yī)科大學學報，2000，26（1）：26-28.

[3]Plouet J,Moro F,Bertagnolli S,et al.Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor 189-amino acid form by urokinase is required for its mitogenic effect[J].J BiolC hem,1997,272:13390-13396.

[4]Sohn YD,Lim HJ,Hwang KC,et al.A novel recombinant basic fibroblastgrowth factor and its secretion[J].Biochem Biophys Res Commun, 2001,284（4）:931-936.