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(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院,廣東珠海 519100)

2000年 Burmester等[1]首次報(bào)道人和小鼠大腦神經(jīng)元中存在腦紅蛋白(NGB)。NGB在缺氧狀態(tài)下能夠特異性地向腦組織供氧,促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)氧攝取、氧運(yùn)輸和氧利用等[2]。Caspase-3[3]是 Caspase家族中最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶,在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用。2008年 9月～2010年 1月,本研究采用免疫組化法與原位雜交法對(duì)大鼠大腦海馬 CA1區(qū)的 NGB與 Caspase-3表達(dá)變化來(lái)探討 NGB與 Caspase-3在腦缺血再灌注損傷的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠與分組 健康 SD大鼠 60只,由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量 250～350 g。隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,各 30只,每組按再灌注的時(shí)間(3、6、12、24、48 h)又分為共 5個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 6只大鼠。

1.2 試劑 兔抗大鼠 NGB多克隆抗體(濃縮型),兔抗大鼠 Caspase-3多克隆抗體(即用型),Caspase-3mRNA原位雜交試劑盒,原位雜交專用 PBS緩沖液,TBS緩沖液,2×SSC緩沖液均由武漢博士德提供。NGBmRNA原位雜交試劑盒由上海和樂(lè)生物科技有限公司提供。

1.3 模型制作 采用 Pulsinelli-Brierley四血管阻塞法建立急性全腦缺血再灌注損傷模型。大鼠稱重后以5%異戊巴比妥鈉按 100mg/kg麻醉,枕下至第五頸椎正中縱行剪開(kāi)皮膚,止血鉗鈍性分離暴露雙側(cè)橫突孔,電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈,24 h后分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,大鼠的角膜反射、翻正反射消失、眼球 2～3 s即變灰、毛發(fā)可豎起,15min后撤去無(wú)損傷動(dòng)脈夾造成再灌注;對(duì)照組只暴露橫突孔,不阻塞椎動(dòng)脈;只分離頸總動(dòng)脈,不夾閉。實(shí)驗(yàn)中有翻正反射、一直抽搐、能吸水者、眼球不變灰者棄之。

1.4 檢測(cè)方法 兩組分別在缺血再灌注后 3、6、12、24、48 h斷頭取腦,放入 4%的多聚甲醛液中固定、蠟塊包埋、切片、烤片,免疫組化按 SABC法進(jìn)行檢測(cè),原位雜交按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。成片Leica DM LB2光學(xué)顯微鏡下觀察,通過(guò) IBM攝像系統(tǒng),運(yùn)用 Viewfinder拍照、采圖軟件進(jìn)行采圖保存。采用 Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)所采圖象進(jìn)行光密度值測(cè)量。存活神經(jīng)元數(shù)目采用HE染色,光鏡下用尺型計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)海馬區(qū)0.5mm存活的神經(jīng)元數(shù)目,光鏡倍數(shù)為 10×40。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件,結(jié)果以±s表示,各組內(nèi)比較采用單因素方差分析并用 q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,兩組間各時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn),各組間用 Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析,以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色后大鼠大腦海馬 CA1區(qū)存活錐體細(xì)胞數(shù)的變化見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠大腦海馬 CA1區(qū) NGB與 Caspase-3表達(dá)的光密度值及其相關(guān)性 見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)組海馬 CA1區(qū) NGB與 Caspase-3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.798,P=0.00)。

2.3 各組大鼠大腦海馬 CA1區(qū) NGBmRNA與Caspase-3mRNA表達(dá)的光密度值及其相關(guān)性 見(jiàn)表 3。實(shí)驗(yàn)組海馬 CA1區(qū) NGBmRNA與 Caspase-3 mRNA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.854,P=0.00)。

表1 再灌注后海馬 CA 1區(qū)存活錐體細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm,±s)

表1 再灌注后海馬 CA 1區(qū)存活錐體細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm,±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.01

組別 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組 83.83±3.66 82.17±2.23 83.16±2.32 84.00±3.58 83.29±2.53實(shí)驗(yàn)組 62.39±2.86 42.83±4.36* 34.00±4.10* 17.83±2.64* 5.00±1.41*

表2 再灌注后海馬 CA 1區(qū)細(xì)胞中 NGB與 Caspase-3表達(dá)的光密度值(±s)

表2 再灌注后海馬 CA 1區(qū)細(xì)胞中 NGB與 Caspase-3表達(dá)的光密度值(±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.05,△P＜0.01

組別 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組NGB 0.148±0.012 0.15±0.008 0.143±0.013 0.149±0.011 0.153±0.007 Caspase-3 0.079±0.003 0.081±0.004 0.082±0.006 0.080±0.003 0.081±0.006實(shí)驗(yàn)組NGB 0.150±0.001 0.146±0.005 0.124±0.002* 0.105±0.003△ 0.085±0.001△Caspase-3 0.083±0.008 0.113±0.005△ 0.136±0.005△ 0.168±0.007△ 0.147±0.005△

表3 再灌注后海馬CA 1區(qū)細(xì)胞中 NGB mRNA與 Caspase-3mRNA表達(dá)的光密度值(±s)

表3 再灌注后海馬CA 1區(qū)細(xì)胞中 NGB mRNA與 Caspase-3mRNA表達(dá)的光密度值(±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.05,△P＜0.01

組別 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對(duì)照組NGBmRNA 0.094±0.006 0.093±0.005 0.093±0.001 0.092±0.007 0.090±0.003 Caspase-3 mRNA 0.089±0.002 0.090±0.003 0.090±0.004 0.088±0.006 0.089±0.004實(shí)驗(yàn)組NGBmRNA 0.095±0.004 0.091±0.002 0.073±0.008* 0.049±0.005△ 0.042±0.002△Caspase-3 mRNA 0.091±0.004 0.142±0.018△ 0.171±0.007△ 0.207±0.008△ 0.189±0.005△

3 討論

腦缺血再灌注損傷是腦缺血難以避免的損傷過(guò)程。NGB與Caspase-3是腦缺血損傷過(guò)程中表達(dá)明確的對(duì)立因素[4,5]。但其對(duì)立性是通過(guò)何種途徑及其哪些因素參與損傷的過(guò)程目前研究不是很明確。本實(shí)驗(yàn)從基因與蛋白角度分別從多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀測(cè) NGB與Caspase-3表達(dá)變化,表明兩者之間的相互制約性,但在時(shí)間上波動(dòng)性的具體機(jī)制不是很明了。缺氧耐受因子-1a(HIF-1α)[6]是一種對(duì)低氧敏感性因子,在缺氧狀態(tài)下表達(dá)量有迅速、短暫的升高,缺氧激活后通過(guò)啟動(dòng)下游低氧反應(yīng)元件參與組織的保護(hù)。研究[7]認(rèn)為 NGB可能是其下游反應(yīng)基因表達(dá)的產(chǎn)物;但同時(shí)大量研究發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重缺氧或持續(xù)缺氧的組織中 HIF-1α可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,可能與 HIF-1α聚集 P53的表達(dá)所致。P53作為轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)一系列下游基因的表達(dá),介導(dǎo)細(xì)胞停止在 G1期,使受損的 DNA有足夠時(shí)間得到修復(fù),如果修復(fù)失敗,則啟動(dòng)凋亡程序,通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)源性 Bcl-2,提高細(xì)胞內(nèi) Bax蛋白的表達(dá),激活Caspase-3等發(fā)揮促凋亡的作用。陳婷芳等論證了NGB啟動(dòng)區(qū)存在 P53結(jié)合位點(diǎn),P53具有增強(qiáng) NGB的轉(zhuǎn)錄功能。因此組織細(xì)胞在缺血凋亡中的動(dòng)態(tài)演變應(yīng)該是失衡—修復(fù)—凋亡;這與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在時(shí)間上差異性表達(dá)趨于一致。海馬 CA1區(qū)是缺血敏感區(qū),神經(jīng)元抵御缺氧能力最低,缺血缺氧誘導(dǎo)一系列抗損傷因子(HIF-1α、P53等)的表達(dá)同時(shí)也潛伏了凋亡因子的轉(zhuǎn)錄。此外,NGB與Caspase-3之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系實(shí)際上是一種時(shí)間上的輪替關(guān)系,為臨床早期干預(yù)缺血后的再灌注損傷提供了依據(jù)。

可見(jiàn),大鼠全腦缺血再灌注后,海馬區(qū) NGB的表達(dá)有助于神經(jīng)元功能的恢復(fù),并隨時(shí)間呈遞減性表達(dá),且與 Caspase-3呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

[1]Burmester T,Weich B,Reinhardt S,etal.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407(6803):520-523.

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[6]李佩堯,張成崗.細(xì)胞內(nèi)低氧感受器:缺氧誘導(dǎo)因子-1脯氨酰羥化酶研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2007,38(1):62-64.

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