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(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院,沈陽 110022)

苯乙酸鈉(NaPA)是一種苯丙氨酸的生理性代謝產(chǎn)物,對多種腫瘤細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)分化和逆轉(zhuǎn)腫瘤表型作用[1～3],且毒性很低,其抗癌作用及其機(jī)制的研究日益受到重視,但其在白血病的研究中鮮見報道。2010年 2～3月,我們通過應(yīng)用不同濃度NaPA誘導(dǎo) HL60細(xì)胞,探討 NaPA在促進(jìn)人白血病細(xì)胞 HL60凋亡中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人白血病細(xì)胞 HL60由沈陽市軍區(qū)總醫(yī)院細(xì)胞生物實驗室提供;NaPA購于美國 Fluka公司;CCK-8購自上海同仁研究所;碘化丙啶(PI)購自美國 Sigma公司;RPMI 1640購自美國 clone公司;ECL化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)購自 Milipore公司;鼠抗人Bcl-2和 Bax單克隆抗體購自美國 Santa cruz公司;血小板衍化生長因子 β(PDGF-β)ELISA試劑盒購自上海研吉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人白血病細(xì)胞 HL60培養(yǎng)于含10%小牛血清和 100 U/m l青霉素和鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng),細(xì)胞懸浮生長。2～3 d傳代 1次,取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 HL60細(xì)胞存活率測定 細(xì)胞生長至對數(shù)生長期,按 1×106個 /ml的細(xì)胞濃度接種于 96孔板,每孔 200μl。設(shè)對照組(無 NaPA誘導(dǎo))和實驗組。實驗組包括 :不同濃度 NaPA(5、10、15 mmol/L)誘導(dǎo) HL60細(xì)胞和不同誘導(dǎo)時間組(12、24、48 h)。各組分別設(shè) 4個復(fù)孔。在 RPMI 1640培養(yǎng)液中依據(jù)實驗設(shè)計加入不同濃度NaPA。實驗結(jié)束后,每孔加入10μl CCK-8溶液。微震蕩后 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 1 h。酶標(biāo)儀上測出波長 450 nm處的各孔光密度(OD值)。細(xì)胞相對存活率 =(OD實驗組/OD對照組)×100%。實驗重復(fù) 3次。

1.2.3 HL60細(xì)胞周期變化檢測 5、10、20 mmol/L NaPA 3個藥物濃度誘導(dǎo) HL60細(xì)胞 24 h進(jìn)行細(xì)胞周期分析,同時設(shè)置對照組(無藥物誘導(dǎo)組)。培養(yǎng)不同時間后收集細(xì)胞用 PBS洗滌 3遍,70%乙醇懸浮細(xì)胞 4℃過夜。然后 PBS洗滌 2遍,PI染色 30 min,檢測分析。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清 PDGF-β檢測 5、10、20 mmol/L的 NaPA誘導(dǎo) HL60細(xì)胞,每個濃度梯度設(shè)立 3個復(fù)孔,同時設(shè)立空白對照孔,24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清。用 ELISA試劑盒檢測 PDGF-β水平,操作按 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 Bcl-2和 Bax的表達(dá)檢測 5、10、20 mmol/L的 NaPA誘導(dǎo) HL60細(xì)胞,并設(shè)置對照組。培養(yǎng) 24 h后,離心收集。收集到的細(xì)胞用預(yù)冷的 PBS漂洗 2遍,加入適量的細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑置冰上30min后,以 12 000 r/min于 4℃離心 10min,調(diào)整蛋白濃度,加入 5×SDS-PAGE加樣緩沖液,置 95～100℃沸水中變性 5 min。80 V恒壓電泳后,過夜轉(zhuǎn)至 PVDF膜上。用 5%脫脂奶粉封閉 1.5 h,TTBS洗膜后,加 1∶1 000稀釋后的一抗,37℃孵育 1.5 h。加HRP標(biāo)記二抗 37℃孵育 40min。洗膜,ECL顯影。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 運用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以±s表示,用 t檢驗分析差異顯著性,以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率 不同濃度 NaPA對 HL60細(xì)胞存活率的影響見表1。由表 1可見,隨著藥物濃度的增加HL60細(xì)胞存活率降低,且呈劑量依賴性(P＜0.01)。

表1 NaPA對 HL60細(xì)胞的存活率的影響(±s)

表1 NaPA對 HL60細(xì)胞的存活率的影響(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.01

組別 12 h 24 h 48 h對照組 100 100 100 NaPA 5mmol/L組 84.69±3.14*76.75±2.41*69.87±3.52*NaPA 10mmol/L組 71.65±3.25*65.45±5.32*58.45±4.32*NaPA 20mmol/L組 54.65±2.09*43.62±4.78*39.72±3.47*F值 743.29 654.27 456.24 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 細(xì)胞周期分布 見表 2。由表2可見,不同濃度 NaPA誘導(dǎo) HL60后 24 h細(xì)胞周期結(jié)果分析表明,DNA合成期(S期)細(xì)胞比例明顯減少,發(fā)生了明顯的G0/G1期阻滯,并呈現(xiàn)出劑量依賴性(P＜0.01)。

表2 不同濃度 NaPA對 HL 60細(xì)胞周期分布的影響(±s)

表2 不同濃度 NaPA對 HL 60細(xì)胞周期分布的影響(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.01

組別 G0/G1期 S期 G2/M期對照組 34.46±1.25 44.12±1.87 21.4±1.75 NaPA 5mmol/L組 56.91±2.34*19.65±2.12*23.44±2.51 NaPA 10mmol/L組 62.67±1.92* 12.81±1.97*24.54±1.47 NaPA 20mmol/L組 70.31±2.61* 3.74±2.08*25.95±3.02 F值 483.85 571.56 4.08 P＜0.01 ＜0.01 ＞0.05

2.3 PDGF-β分泌 在 NaPA誘導(dǎo) HL60細(xì)胞的上清液中,對照組、NaPA 5、10、20mmol/L組 PDGF-β的分泌量分別為(825.64±57.24)、(512.58±64.45)、(323.51±45.61)和(218.43 ±51.34)pg/ml,隨著 Na-PA的誘導(dǎo)濃度增大而降低(F=18 120,P＜0.01)。

2.4 Bcl-2及 Bax表達(dá) 5、10、20 mmol/L的 NaPA誘導(dǎo) HL60細(xì)胞 Bcl-2的表達(dá)量隨 NaPA誘導(dǎo)濃度增加而降低,而 Bax的表達(dá)量隨 NaPA誘導(dǎo)濃度增加而明顯增加。見圖 1。

圖1 Bcl-2及 Bax蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果

3 討論

NaPA作為一種對人體無毒性的分化誘導(dǎo)劑,具有誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞向成熟分化[4]和凋亡等生物學(xué)作用,因此日益受到重視。但其作用機(jī)制尚未完全明確,仍然需要進(jìn)一步的探索。

本研究結(jié)果表明,NaPA可通過影響人白血病細(xì)胞 HL60的 G0/G1期到 S期這個關(guān)鍵點而抑制人白血病細(xì)胞 HL60細(xì)胞的生長,使腫瘤細(xì)胞生長阻滯在G0/G1期,且這種變化呈劑量依賴。轉(zhuǎn)化生長因子 β是一種多功能細(xì)胞因子,可通過調(diào)節(jié)微環(huán)境中的生長因子來正負(fù)調(diào)控各種細(xì)胞的增殖。其促增殖作用主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞 c-sis基因編碼的PDGF-β起作用。本文研究結(jié)果表明,人白血病細(xì)胞HL60的培養(yǎng)上清液中PDGF-β分泌量隨著NaPA的誘導(dǎo)濃度增大而降低。因此推測 NaPA可通過調(diào)節(jié)生長因子的合成及釋放來影響細(xì)胞生長。Bcl-2是細(xì)胞死亡的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,可延長非周期細(xì)胞的壽命,抑制周期細(xì)胞的凋亡。而同屬 Bcl-2家族的Bax的作用與 Bcl-2相反,可促進(jìn)凋亡[5]。本研究結(jié)果表明,將 NaPA作用于人白血病細(xì)胞 HL60,檢測到 Bcl-2降低,同時發(fā)現(xiàn) Bax的表達(dá)增高。與 Adam等[6]研究得到的結(jié)果相似。據(jù)此可推測調(diào)節(jié) Bcl-2家族中的 Bcl-2和 Bax的表達(dá)為 NaPA誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

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