羅 云，黎杏群，唐 濤，羅杰坤，智屹惠，萬賽英

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，湖南長沙 410008)

生長相關(guān)蛋白43(growth-associated protein-43，GAP-43)是一種與軸突生長相關(guān)的蛋白質(zhì)，主要存在于生長錐，其作用是促進軸突生長及神經(jīng)細胞分化，參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)與功能重塑，腦缺血時在缺血半暗區(qū)GAP-43表達增加，參與缺血后神經(jīng)重塑。

最近10 多年來，我國采用腦血康[1]、清開靈[2]等中藥對輕中度腦出血進行基礎(chǔ)和臨床研究，結(jié)果表明能降低致殘率，提高患者的生活質(zhì)量。腦溢安顆粒是我所研制的用于腦出血急性期的中藥三類新藥。研究表明，腦溢安顆粒具有促進神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)尤其是NT-3表達的作用。實驗證實，NT-3促進GAP-43的表達，由此推測通過使用腦溢安顆粒促進腦出血時NT-3的表達后，也會促進GAP-43的表達。因此，本次實驗將運用免疫組織化學(xué)和原位雜交方法研究缺氧損傷大鼠神經(jīng)干細胞GAP-43的表達狀況以及腦溢安對GAP-43表達的影響，以期闡明腦溢安治療腦出血的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康Sprague-Dawley雄性大鼠，清潔級，體重200g～250g;Sprague-Dawley乳鼠，出生7d左右，雌雄不拘，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供。

1.2 主要試劑

腦溢安(NYA)浸膏(湘雅醫(yī)院自制)、兔GAP-43多克隆抗體和兔抗Nestin多克隆抗體(Boster)、bFGF及EGF(Pepro Tech EC)、DMEM/F12干粉培養(yǎng)基(Sigma)、胰蛋白酶(Sigma)、胎牛血清(四季青)、SABC試劑盒、DAB試劑盒、GAP-43原位雜交試劑盒(武漢博士德)。

我所配制的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)相關(guān)液體包括配制神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基、0.05%胰酶-0.04%EDTA消化液、D-Hank's液、EGF(2μg/ml)、青霉素-鏈霉素雙抗貯存液、bFGF貯存液(2μg/ml)、DNase I貯存液(0.05%)，配制過程略。

1.3 方法

1.3.1 腦溢安(NYA)血清的制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠3d后，用腦溢安浸膏13.12g/(kg·d)灌胃，前3d于8am、4pm各灌藥6.56g/kg，第4天于8 am灌藥13.12 g/kg。給藥1h后，心臟內(nèi)采血取血清，－20℃冷凍備用。正常大鼠血清的制備過程除每次灌服等量生理鹽水代替腦溢安浸膏外，其余過程同前。

1.3.2 海馬神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)和傳代參照Zhao[3]的方法取新生大鼠大腦并分離海馬，剪碎后移入50ml離心管內(nèi)，加入0.05%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化液10ml及0.05%DNase I 1ml，37℃消化20min～25min，20%胎牛血清終止消化，200目篩網(wǎng)過濾，濾液1100rpm離心10min，去上清，沉淀用D-Hank's液洗3遍，加入神經(jīng)干細胞選擇培養(yǎng)基，吸管反復(fù)吹打制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度，按1×105個/ml接種于塑料培養(yǎng)瓶，置于細胞培養(yǎng)箱，在37℃ 5%CO2的條件下培養(yǎng)。每3d半量換液，待原代克隆形成后(約7d～10d)，將培養(yǎng)液移入15ml離心管內(nèi)，1100rpm離心10min，去上清。細胞沉淀用0.125%胰酶消化10min～15min，20%胎牛血清終止消化，離心后去上清，細胞沉淀用DHank's液洗3次，加入神經(jīng)干細胞選擇培養(yǎng)基，反復(fù)吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度，按1×105個/ml接種于塑料培養(yǎng)瓶，置于細胞培養(yǎng)箱，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.3.3 鑒定細胞克隆為神經(jīng)干細胞 將細胞培養(yǎng)基吸入15ml離心管內(nèi)，滴于預(yù)先用多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)包被的載玻片上，電風(fēng)扇吹干后將載玻片置于4%的多聚甲醛中固定15min，進行nestin(1∶100)免疫細胞化學(xué)染色(參照SABC試劑盒說明)。

1.3.4 缺氧損傷模型的建立及分組 將神經(jīng)干細胞克隆用0.125%胰酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞密度為1×105個/ml接種至塑料培養(yǎng)瓶，待細胞快速生長期時，更換培養(yǎng)液后將其移入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱(37℃、95%N2、5%CO2)內(nèi)培養(yǎng)6h造成缺氧損傷模型。實驗分為4組:①空白組:正常培養(yǎng)，不造成缺氧損傷模型;②模型組:將神經(jīng)干細胞放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6h，造成缺氧損傷;③正常血清對照組:模型組基礎(chǔ)上加入含5%正常大鼠血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12h;④腦溢安組:模型組基礎(chǔ)上加入含5%腦溢安血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12h。

1.3.5 免疫細胞化學(xué)檢測GAP-43蛋白的表達 分別取上述4組神經(jīng)干細胞，滴加至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的載玻片上，4%多聚甲醛室溫固定30min，參照SABC試劑盒說明進行免疫細胞化學(xué)檢測。

1.3.6 Western blot檢測GAP-43蛋白的表達

分別取上述4組神經(jīng)干細胞，加入細胞裂解液提取蛋白，Bradford法粗測定蛋白濃度，液氮保存。取樣品(20μl)進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)入NC膜封閉，加一抗、二抗之后DAB顯色成像。

1.3.7 原位雜交檢測GAP-43 mRNA的表達

分別取前述4組神經(jīng)干細胞，滴加至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的載玻片上，4%多聚甲醛室溫固定30min，按原位雜交試劑盒中操作說明進行GAP-43原位雜交。

1.3.8 結(jié)果觀察與統(tǒng)計分析 免疫細胞化學(xué)染色和原位雜交的結(jié)果觀察，每組取5個標(biāo)本，每個標(biāo)本取5個互不重疊的陽性反應(yīng)視野，用 Motic Images軟件分別測定各個視野陽性細胞的著色強度，用灰度值表示(著色強度越低，灰度值越高)。Western blot結(jié)果采用Bandlead3.0圖像分析系統(tǒng)測定蛋白帶的光密度，進行半定量分析。結(jié)果用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行分析，多組比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細胞的鑒定

原代細胞接種于培養(yǎng)瓶1d～2d后，大部分細胞死亡，少部分細胞貼壁形成2～4個細胞的細胞克隆，更換培養(yǎng)基，此后每3d半量換液，7d～10d形成大小不一由眾多細胞組成的細胞團，形態(tài)類似圓球狀，即神經(jīng)球(見圖1、圖2)。將神經(jīng)球用0.05%胰酶-0.04%EDTA進行消化傳代，7d～10d仍出現(xiàn)新的神經(jīng)球;原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)所形成的神經(jīng)球，其nestin免疫細胞化學(xué)染色均為陽性(見圖3)。

圖1 神經(jīng)球(×100)

圖2 神經(jīng)球(×400)

圖3 神經(jīng)球nestin染色陽性(×400)

2.2 缺氧損傷神經(jīng)干細胞GAP-43蛋白表達

免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，各組均有GAP-43表達，與模型組相比較，正常血清對照組和腦溢安血清組神經(jīng)干細胞GAP-43平均灰度值均較低(P<0.01)，腦溢安血清組低于正常血清對照組(P<0.01)(見表1)。Western blot結(jié)果測得GAP-43蛋白表達的量與免疫細胞化學(xué)結(jié)果相似(見表2、圖4)。

表1 缺氧損傷后各組神經(jīng)干細胞GAP-43蛋白的灰度值(s，n=5)

表1 缺氧損傷后各組神經(jīng)干細胞GAP-43蛋白的灰度值(s，n=5)

注:與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01;與正常血清對照組比較:**P<0.01

組平均灰度值空白組別61.2±8.775模 型 組 58.0 ±7.581**正常血清對照組 48.8±8.168△腦 溢 安 血 清 組 33.8±8.387△△**

圖4 各組神經(jīng)干細胞GAP-43免疫印跡圖

表2 缺氧損傷后各組神經(jīng)干細胞GAP-43蛋白的光密度值(s，n=5)

表2 缺氧損傷后各組神經(jīng)干細胞GAP-43蛋白的光密度值(s，n=5)

注:與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01;與正常血清對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

組光密度值空 白 組 164.0±6.453別△△**模 型 組 178.1±6.232*正常血清對照組 186.4±4.011△腦 溢 安 血 清 組 194.1±1.975△△*

2.3 缺氧損傷神經(jīng)干細胞GAP-3 mRNA表達

原位雜交結(jié)果顯示，各組均有GAP-43 mRNA表達，與模型組相比較，正常血清對照組和腦溢安血清組神經(jīng)干細胞GAP-43 mRNA的平均灰度值均較低(P<0.01)，腦溢安血清組較正常血清對照組低(P<0.01)。上述結(jié)果說明，正常血清對照組和腦溢安血清組神經(jīng)干細胞GAP-43 mRNA的表達均較模型組多，腦溢安血清組神經(jīng)干細胞GAP-43 mRNA的表達較正常血清對照組多(見表3、圖5、圖6)。

表3 缺氧損傷后各組神經(jīng)干細胞GAP-43 mRNA的灰度值(平均灰度值/個細胞，s，n=5)

表3 缺氧損傷后各組神經(jīng)干細胞GAP-43 mRNA的灰度值(平均灰度值/個細胞，s，n=5)

注:與模型組比較:△△P<0.01;與正常血清對照組比較:**P<0.01

組平均灰度值空白組別97.4±7.701模 型 組 93.8 ±8.194**正常血清對照組 82.4±6.140△△腦 溢 安 血 清 組 71.8±7.588△△**

圖5 原位雜交:缺氧損傷神經(jīng)球可見GAP-43 mRNA的表達(SABC×100)

圖6 腦溢安血清促進缺氧損傷神經(jīng)球GAP-43 mRNA的表達(SABC×100)

3 討論

本實驗對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞進行厭氧培養(yǎng)，制成缺氧損傷細胞模型，模擬腦出血體內(nèi)神經(jīng)干細胞所處的病理環(huán)境，用免疫細胞化學(xué)、Western blot和原位雜交分別從蛋白和mRNA水平，觀察缺氧損傷神經(jīng)干細胞GAP-43的表達，以及腦溢安血清對缺氧損傷神經(jīng)干細胞GAP-43表達的影響，以便從GAP-43和神經(jīng)干細胞的關(guān)系的角度進一步闡明腦溢安治療腦出血促進神經(jīng)恢復(fù)的機制。結(jié)果顯示，空白組(正常培養(yǎng)未造成缺氧損傷模型)和模型組均表達GAP-43，腦溢安血清組GAP-43的表達明顯增加。提示神經(jīng)干細胞和缺氧損傷神經(jīng)干細胞均有GAP-43的表達，腦溢安促進缺氧損傷神經(jīng)干細胞GAP-43的表達。

神經(jīng)干細胞有兩個特征:一是具有自我更新能力;二是具有多分化潛能，即神經(jīng)干細胞可分化為神經(jīng)元、星狀細胞和少突膠質(zhì)細胞[4]。它們主要存在于成年哺乳動物的管室膜、SVZ及海馬[5]等區(qū)域。正常機體腦內(nèi)神經(jīng)干細胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)機體受到諸如腦缺血、腦外傷、腦出血等疾病的損傷時，靜止的神經(jīng)干細胞被激活，發(fā)生增殖、遷移和分化，參與對損傷的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后海馬、管室膜和SVZ等區(qū)域的神經(jīng)干細胞發(fā)生增殖，向病灶處遷移，并可分化為神經(jīng)元和星狀細胞[6-7]。我們在以前的研究工作中也觀察到，與腦缺血后情況相類似，腦出血后體內(nèi)神經(jīng)干細胞也會被激活而發(fā)生增殖，這些被激活的神經(jīng)干細胞主要分布于血腫周圍的基底節(jié)區(qū)、側(cè)室管膜和相鄰的SVZ[8]。至于腦損傷后其內(nèi)源性神經(jīng)干細胞被激活的機制目前尚不十分清楚。有研究提示，參與激活的因素有腦損傷部位表達增加的整合素配體、多聚唾液酸神經(jīng)細胞黏附分子(polysialated neural cell adhesion molecule，PSANCAM)、生長因子bFGF、EGF、神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和NT-3[9]，以及由損傷所致釋放增加的興奮性谷氨酸[10]等。在上述可激活神經(jīng)干細胞的化學(xué)物質(zhì)中，尤其值得注意的是興奮性谷氨酸和神經(jīng)營養(yǎng)因子。如果在腦缺血后即給予興奮谷氨酸NMDA受體拮抗劑MK-801，可阻斷海馬神經(jīng)干細胞的增殖[10]，說明興奮性谷氨酸參與了腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖過程，促進神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元方向分化;NT-3不僅可以促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖，體外實驗還證實，它還可促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化[11]，促進與神經(jīng)遞質(zhì)合成相關(guān)的酶基因表達(膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 mRNA和酪氨酸羥化酶mRNA)。激活的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞可能通過以下機制參與神經(jīng)修復(fù)[12]:①在受損神經(jīng)元和由神經(jīng)干細胞分化而來的神經(jīng)元之間形成突觸中繼(synaptic relay)，并通過突觸中繼這種“神經(jīng)元橋(neuronal bridges)”的形成使軸突“主動”再生;②為軸突生長提供基質(zhì);③幫助無髓或新生軸突形成髓鞘。在上述第1種機制中，突觸中繼的形成需要受損神經(jīng)元和由神經(jīng)干細胞分化而來的神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)纖維參與，涉及軸突再生，GAP-43是軸突生長必不可少的蛋白質(zhì)[13]，那么激活的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞在參與對損傷的修復(fù)過程中一定伴隨著 GAP-43的表達[14]。本實驗觀察到，腦出血大鼠腦內(nèi)有GAP-43表達，缺氧損傷神經(jīng)干細胞GAP-43有表達。因此可以認為，缺氧損傷神經(jīng)干細胞表達的GAP-43參與突觸中繼的形成，有助于由神經(jīng)干細胞分化而來的神經(jīng)元的軸突生長。

如前所述，GAP-43除與軸突生長密切相關(guān)外，還可通過抑制細胞凋亡參與損傷的修復(fù)。人們通過以下兩方面對GAP-43抑制細胞凋亡的作用進行了證實:①用一些給予措施抑制細胞凋亡后，GAP-43表達增加[15];②抑制GAP-43表達后，細胞凋亡增加[16]。我們在以前研究工作中觀察到，腦出血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞被激活而發(fā)生增殖[17]。本實驗觀察到缺氧損傷的體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞有GAP-43的表達，既然GAP-43可通過抑制細胞凋亡參與損傷，那么我們認為缺氧損傷神經(jīng)干細胞表達增加的GAP-43的作用在于抑制神經(jīng)干細胞本身的凋亡，維持其存活狀態(tài)，有利于損傷的修復(fù)。

本實驗觀察到，腦溢安促進缺氧損傷神經(jīng)干細胞GAP-43的表達。結(jié)合我們以前工作的觀察結(jié)果，腦溢安促進腦出血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細胞的增殖[17]，抑制體外培養(yǎng)的缺氧損傷神經(jīng)干細胞Capase-3活性，抑制細胞凋亡。并根據(jù)其他研究者對于GAP-43的作用的研究結(jié)果，GAP-43促進軸突生長和通過抑制細胞凋亡參與損傷的修復(fù)[15、16]。我們認為，腦溢安促進缺氧損傷神經(jīng)干細胞GAP-43表達的意義可能在于:①促進由腦出血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞分化而來的神經(jīng)元的軸突生長，以利于受損神經(jīng)元建立突觸中繼，參與腦出血后的神經(jīng)重塑;②抑制內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的凋亡，維持其存活狀態(tài)，有利于損傷的修復(fù)。這可能腦溢安防治腦出血的機制之一。

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