董建勛，朱朝軍，路廣林，李 健，張美吉，王樂(lè)平，羅 玲

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

本文采用免疫組織化學(xué)法分析了經(jīng)穴注射BMMSCs治療21 d后大鼠后肢缺血骨骼肌VEGF標(biāo)記的毛細(xì)血管密度、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)標(biāo)記的小動(dòng)脈密度以及TNF-α和TGF-β1蛋白的表達(dá)量，嘗試探索VEGF、TNF-α和TGF-β1在血管新生和動(dòng)脈生成之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)大鼠BM-MSC:SD大鼠BM-MSCs、SD大鼠BM-MSCs完全培養(yǎng)液均購(gòu)自 Cyagen Biosciences(Guangzhou)Inc。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠24只，體質(zhì)量200g±20g，雌雄不限，購(gòu)自北京市維通利華公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2007-0001;(2)主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備:MC0175CO:細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司)，OLYMPUSix-71倒置顯微鏡，Nikon C-SHG1圖像分析系統(tǒng);(3)主要試劑:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β(TGF-β1)一抗及兔SP Kit一抗為兔來(lái)源的免疫組化試劑盒，均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。α-SMA一抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 動(dòng)物及分組

選擇健康SD大鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，稱重后隨機(jī)分對(duì)照組、模型組、經(jīng)穴注射BM-MSC治療組(經(jīng)穴組)和肌肉注射BM-MSC治療組(肌注組)4組。于造模前、后自由進(jìn)食、飲水，同等條件下飼養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物模型制備

［1］的方法，在無(wú)菌操作下麻醉大鼠后(腹腔注射10%水合氯醛，3.5 ml/kg)仰臥固定于鼠板上。自其左腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)上行一縱行切口，分離股動(dòng)脈及分支。然后用5-0絲線在近左髂總動(dòng)脈、腘動(dòng)脈兩處結(jié)扎股動(dòng)脈及分支，從兩處結(jié)扎的絲線中間離斷股動(dòng)脈及其分支，造成下肢缺血模型，隨后縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后不做抗感染處理。

1.4 治療方法

經(jīng)穴組在手術(shù)左側(cè)后肢選取“三陰交”、“后三里”、“照?！?、“環(huán)跳”、“陽(yáng)陵泉”5個(gè)穴位注射 BMMSCs。按照華興邦等［2］大鼠穴位圖譜研制一文中經(jīng)穴的定位取穴。肌注組在左側(cè)后肢缺血大腿內(nèi)側(cè)從上至下選取非穴位5點(diǎn)注射BM-MSCs。模型組選取的注射部位同肌注組，注射磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對(duì)照。術(shù)后立即用微量注射器行BMMSC單次注射，注射深度1cm，注射后不做任何手法處理。經(jīng)穴組、肌注組每只大鼠注射BM-MSC 5×106個(gè)，每穴/點(diǎn)注射0.2ml細(xì)胞混懸液，含BM-MSC 1×106個(gè)，只注射1次。模型組大鼠左側(cè)后肢注射等量的PBS。經(jīng)穴組、肌注組、模型組3組大鼠右肢體不做任何處理，作為正常對(duì)照?？瞻讓?duì)照組大鼠不做任何處理。

1.5 α-SMA表達(dá)陽(yáng)性小動(dòng)脈密度的計(jì)算

經(jīng)穴注射BM-MSCs 21d后，麻醉大鼠后取大鼠后肢內(nèi)收肌、腓腸肌，甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，按肌肉橫斷面切片厚約5μm(在北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室進(jìn)行)。用抗平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記血管壁上的平滑肌，認(rèn)為α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的部位是小動(dòng)脈所在。使用Nikon CSHG1圖像分析系統(tǒng)(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室提供)隨機(jī)選10個(gè)視野，在高倍鏡(10×40)下計(jì)算小動(dòng)脈的密度，為減少誤差用鏡下小動(dòng)脈數(shù)/肌束數(shù)(小動(dòng)脈密度)來(lái)表示，取其平均值。

1.6 VEGF陽(yáng)性表達(dá)血管的計(jì)算

按照博奧森即用型免疫組化試劑盒說(shuō)明書染色，鏡檢有棕黃色顆粒為陽(yáng)性。免疫組織化學(xué)VEGF染色，血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，該毛細(xì)血管即為VEGF陽(yáng)性表達(dá)的血管。隨機(jī)選取10個(gè)視野，在高倍鏡(10×40)下觀察計(jì)數(shù)VEGF陽(yáng)性表達(dá)的血管數(shù)，取其平均值。

1.7 TGF-β1和 TNF-α 表達(dá)測(cè)定

按照博奧森即用型免疫組化試劑盒說(shuō)明書染色，鏡檢有棕黃色顆粒為陽(yáng)性。同時(shí)設(shè)不加一抗的非特異性對(duì)照。采用尼康圖像分析儀對(duì)免疫組化顯色結(jié)果進(jìn)行分析。每組選10個(gè)高倍視野(10×40)圖片，計(jì)算視野中陽(yáng)性表達(dá)的面積(AREA)×平均光密度(MOD)值，取其平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用LSD進(jìn)行多重比較，多元相關(guān)分析采用Pearson檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 小動(dòng)脈密度及VEGF陽(yáng)性表達(dá)血管數(shù)的比較

表1和圖1、2顯示，正常骨骼肌中，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體陽(yáng)性細(xì)胞只能在小血管的平滑肌細(xì)胞中觀察到。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，肌注組和經(jīng)穴組小動(dòng)脈密度指數(shù)及VEGF陽(yáng)性表達(dá)的血管數(shù)都顯著升高 (P<0.01);與模型組比較，經(jīng)穴組及肌注組小動(dòng)脈密度指數(shù)VEGF陽(yáng)性表達(dá)的血管數(shù)均顯著升高(P<0.01);與肌注組比較，經(jīng)穴組小動(dòng)脈密度指數(shù)及VEGF陽(yáng)性表達(dá)的血管數(shù)均顯著升高(P<0.01)。

表1 各組大鼠缺血后肢骨骼肌橫切小動(dòng)脈密度及VEGF陽(yáng)性表達(dá)血管數(shù)(±s)

表1 各組大鼠缺血后肢骨骼肌橫切小動(dòng)脈密度及VEGF陽(yáng)性表達(dá)血管數(shù)(±s)

注:與對(duì)照組比較，**P<0.01;與模型組比較，▲▲ P<0.01;與肌注組比較，△P<0.05，△△P<0.01

組 別 n 小動(dòng)脈密度指數(shù) VEGF 陽(yáng)性表達(dá)血管數(shù)對(duì)照組6 0.85±0.06 9.375±1.19模型組 6 0.90±0.09 10.50 ±1.20肌注組 6 1.40±0.11**▲▲ 17.00 ±2.62**▲▲經(jīng)穴組 6 1.80±0.07**▲▲△△ 19.875±2.59**▲▲△△

圖1 抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白標(biāo)記的小動(dòng)脈

圖2VEGF標(biāo)記的毛細(xì)血管

2.2 免疫組化學(xué)TGF-β1和TNF-α表達(dá)量測(cè)定

表2、圖3、4顯示，免疫組織化學(xué)法對(duì)各組大鼠骨骼肌切片染色，并比較了TGF-β1和TNF-α等蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明，與模型組比較，經(jīng)穴組及肌注組 TGF-β1和 TNF-α表達(dá)量均顯著升高(P<0.01);與肌注組比較，經(jīng)穴組 TGF-β1和 TNF-α 表達(dá)量均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組大鼠缺血骨骼肌橫切免疫組化TGF-β1和TNF-α表達(dá)量測(cè)定結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠缺血骨骼肌橫切免疫組化TGF-β1和TNF-α表達(dá)量測(cè)定結(jié)果(±s)

注:與對(duì)照組比較:**P<0.01;與模型組比較:▲▲P<0.01;與肌注組比較:△P<0.05△△P<0.01;面積(AREA)×平均光密度(MOD)值

組 別 n TGF-β1 TNF-α對(duì)照組6 11.67±1.98 1.98±0.42模型組 6 11.99±4.89 2.55±0.79肌注組 6 20.80±5.03**▲▲ 7.05±2.34**▲▲經(jīng)穴組 6 25.63±3.23**▲▲△ 11.18±1.78**▲▲△△

圖3 各組大鼠缺血骨骼肌橫切TGF-β1的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，10×40)

圖4 各組大鼠缺血骨骼肌橫切TNF-α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，10×40)

3 討論

胚胎發(fā)生后，成人的新生血管形成主要有兩種機(jī)制，一是血管新生，通過(guò)局部毛細(xì)血管的增生而增加局部的血流量;二是動(dòng)脈生成，已存在的高阻力側(cè)支血管擴(kuò)增來(lái)減少血流阻力而增加缺血區(qū)域的血流量［3］。在血管新生及動(dòng)脈生成的過(guò)程中 VEGF、bFGF、TGF-β1和 TNF-α［4］等血管生長(zhǎng)因子發(fā)揮重要作用。本研究證實(shí)，經(jīng)穴組a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)表達(dá)陽(yáng)性的小動(dòng)脈密度和VEGF陽(yáng)性表達(dá)毛細(xì)血管密度顯著高于肌注組。所以我們認(rèn)為，經(jīng)穴注射BM-MSCs改善大鼠后肢血流的過(guò)程中，既存在血管新生又存在著肌性動(dòng)脈形成的動(dòng)脈生成。

3.1 TGF-β1、TNF-α 與新生血管新成

TNF-a是一種強(qiáng)有力的促血管生成因子，TNF-a通過(guò)間接和直接作用促進(jìn)血管新生。間接作用是通過(guò)上調(diào) VEGF、VEGF受體2和 bFGF［5］的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，直接作用是通過(guò)與bFGF和VEGF共同作用，TNF-a和bFGF以及VEGF等共同誘導(dǎo)人體微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生形成毛細(xì)血管樣管狀結(jié)構(gòu)，在此過(guò)程中TNF-a能上調(diào)促進(jìn)形成毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)所必須的尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的形成［6］。

TGF-β是已知的促血管生長(zhǎng)因子，在組織修復(fù)、血管形成中起重要作用。TGF-β1是TGF-β家族的主要成員，是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)和其他各種功能的主要細(xì)胞因子。研究表明，TGFβ1可以刺激垂體前葉濾泡星形細(xì)胞自分泌和旁分泌堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，而促進(jìn)血管新生。更重要的是，TGFβ1對(duì)血清剝奪和低氧誘導(dǎo)MSCs的凋亡具有抑制作用，TGF-β還能促進(jìn)BM-MSCs增殖并較長(zhǎng)期保持其生物活性。故MSC分泌的TGFβ1既能減少M(fèi)SC的凋亡又能促進(jìn)其增殖，反過(guò)來(lái)MSC的存活率高又分泌更多的TGFβ1，二者形成良好的相互作用。經(jīng)穴注射BM-MSCs后，TGFβ1在缺血肌肉組織表達(dá)增加，能抑制血清剝奪和低氧誘導(dǎo)BM-MSCs的凋亡，并且促進(jìn)BM-MSC增殖并較長(zhǎng)期保持其生物活性，從而提高注射的BMMSCs存活率，使得更多的 BM-MSCs分泌 VEGF、bFGF和TGFβ1，發(fā)揮治療性血管生成的作用。

3.2 相關(guān)血管生長(zhǎng)因子在新生血管形成中的相互作用

前期研究表明，經(jīng)穴注射BM-MSCs能顯著提高血漿和免疫組化VEGF、bFGF蛋白表達(dá)量。在血管新生過(guò)程中，VEGF與bFGF存在相互作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)多元相關(guān)分析表明，VEGF(R=0.898，P<0.01)和bFGF(R=0.813，P<0.05)免疫組化蛋白表達(dá)量都與小動(dòng)脈密度顯著相關(guān)，VEGF和bFGF免疫組化蛋白表達(dá)量也顯著相關(guān)(R=0.955，P<0.01)。有研究表明，VEGF是bFGF發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，Seghezzi等用VEGF抗體中和VEGF就能抑制bFGF誘導(dǎo)的血管生成，他們還提出bFGF主要通過(guò)細(xì)胞的自分泌和旁分泌途徑上調(diào)VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，故本實(shí)驗(yàn)血管生長(zhǎng)過(guò)程中也存在bFGF與VEGF的協(xié)同作用。此外，TGF-β1和 TNF-α也都與 VEGF和bFGF之間存在相互作用。

TNF-α能與bFGF和VEGF通過(guò)直接或間接作用參與新生血管形成。而TGFβ1可以刺激成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的分泌，還通過(guò)抑制 BM-MSCs的凋亡產(chǎn)生更多的bFGF和VEGF而促進(jìn)血管新生。故經(jīng)穴注射BMMSCs能顯著增加后肢缺血大鼠小動(dòng)脈密度和VEGF陽(yáng)性表達(dá)毛細(xì)血管密度。

經(jīng)穴注射 BM-MSCs后，產(chǎn)生更多的 VEGF、bFGF、TGFβ1和 TNF-a，4 種血管生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，TGFβ1既能提高BM-MSCs的存活率，又能上調(diào)VEGF、bFGF的表達(dá)和注射 MSCs分泌的 VEGF、bFGF共同促進(jìn)血管新生、動(dòng)脈生成，所以經(jīng)穴注射BM-MSCs較肌內(nèi)注射BM-MSCs能顯著提高小動(dòng)脈密度及VEGF陽(yáng)性表達(dá)毛細(xì)血管密度。

總之，經(jīng)穴注射BM-MSC，調(diào)暢經(jīng)絡(luò)之氣血，濡養(yǎng)三陰、三陽(yáng)之經(jīng)脈，滋養(yǎng)神經(jīng)組織，通過(guò)對(duì)軀體傷害性傳入的抑制效應(yīng)達(dá)到鎮(zhèn)痛效果，從而使缺血肢體氣血調(diào)和、脈絡(luò)通暢，癥狀得以緩解。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)講，(1)經(jīng)穴注射BM-MSCs可以產(chǎn)生更多的VEGF、bFGF、TGFβ1和 TNF-α等多種血管生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)血管新生和動(dòng)脈生成;(2)可以產(chǎn)生更多的TGFβ1抑制BM-MSCs的凋亡并且促進(jìn)其增殖;(3)可以通過(guò)分泌的VEGF促進(jìn)神經(jīng)突觸延伸，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)新生作用，減輕缺血缺氧對(duì)下肢周圍神經(jīng)的損害，從而減輕癥狀。簡(jiǎn)而言之，經(jīng)穴注射BM-MSCs，可以產(chǎn)生更多的 VEGF、bFGF、TGFβ1和TNF-α等多種血管生長(zhǎng)因子，更好地發(fā)揮BM-MSCs的新生血管形成作用。

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