車 頔,應(yīng) 超,李秀英,金小翠,秦元華,崔 昱

隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)主要寄生于小腸上皮細胞的刷狀緣納蟲空泡內(nèi),可導(dǎo)致人體嚴重腹瀉,對人類的身體健康造成嚴重的危害。目前對隱孢子蟲病尚無特效抗蟲藥,但鑒于隱孢子蟲病發(fā)病特點與免疫功能密切相關(guān),因此,治療中應(yīng)兼顧提高免疫力與抑殺蟲體。本實驗選用補骨脂與雙氫青蒿素二者配伍治療隱孢子蟲病鼠,期望為隱孢子蟲病免疫及中藥防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠60只,雌雄各半,體重28～32g(購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。連續(xù)3d糞檢均無隱孢子蟲卵囊排出。

1.2 主要試劑與儀器地塞米松磷酸鈉注射液(批號:0705121,5mg/mL,泗水希爾康制藥有限公司),補骨脂(市售中草藥,自制水煎劑,20g/100mL),雙氫青蒿素粉劑(陜西森弗生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

掃描電鏡(JSM-6360LV,日本),透射電鏡(JEM-2000EX,日本)。

1.3 實驗動物處理 60只小鼠隨機分成5組(每組12只,雌雄各半,雌雄分開):A組為正常對照組;B組為模型組;C組為補骨脂治療組;D組為雙氫青蒿素治療組;E組為補骨脂與雙氫青蒿素合劑治療組,并按治療1～ 2w 時間分成 A1、A2;B1、B2;C1、C2;D1、D2;E1、E2共計 10組。除 A 組外,其余各組小鼠每w2次經(jīng)腹股溝皮下注射0.05mL地塞米松磷酸鈉注射液(濃度5mg/mL),同時采用改良抗酸染色法觀察小鼠糞便中是否出現(xiàn)隱孢子蟲卵囊。4w后,各組小鼠糞便中均有卵囊出現(xiàn)。停止地塞米松磷酸鈉注射,開始進行中藥治療。

A組每d灌服1次蒸餾水(0.5mL/只),藥物治療組C、D、E分別灌胃給藥(自制補骨脂藥劑的濃度為20%(3.4g/kg);雙氫青蒿素劑量 60mg/kg;合劑組為補骨脂與雙氫青蒿素劑量各半,灌胃前混合,每d 1次。

每d觀察小鼠的一般狀態(tài),包括毛色、攝食、活動、體重等。1w后每組隨機取出3只雌性和3只雄性小鼠,將小鼠斷頸處死,取十二指腸與空腸交界處約1cm的小腸組織進行病理學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)的觀察。中藥治療2w后,重復(fù)上述方法留取待測標本。

1.4 光鏡樣品的制備及觀察 將留取的小腸標本置于中性福爾馬林固定12h后將樣品修塊、石蠟包埋、HE染色,鏡檢、記錄和顯微照相。

1.5 掃描電鏡樣品的制備觀察 根據(jù)石蠟切片結(jié)果取舍電鏡樣品,十二指腸與空腸的角交界處腸組織1cm,循長軸剖開,置PBS漂凈腸內(nèi)容物后。在觀察前,再用新手術(shù)刀片修塊,修成2～3mm大小的組織塊,然后用 30%、50%、70%、80%、90%乙醇、2份無水乙醇以及醋酸異戊酯在微波爐中逐漸脫水1min;再進行CO2干燥,粘塊,噴金,最后在JSM-6360LV型掃描電鏡下觀察,拍照。

1.6 透射電鏡樣品的制備及觀察 將小鼠斷頸處死,立即置于冰袋上,取盲腸以上約2cm處新鮮的回腸組織,修成1～2mm3大小的組織塊,立即置于2.5%的戊二醛中,預(yù)固定2h,OsO4后固定2h,梯度乙醇及丙酮脫水,EPON812環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,乙酸鈾-檸檬酸鉛雙染色,在透射電鏡(JEM-2000EX)下觀察,拍照。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般狀況觀察以及排卵囊規(guī)律 正常對照組:精神狀態(tài)和食欲良好,運動活躍,毛發(fā)順滑而有光澤。陽性對照組:精神萎靡,活動減少,毛色晦暗,體重下降,出現(xiàn)腹瀉,甚至死亡。藥物治療組:活動日趨頻繁,食欲及體重增加,狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。

經(jīng)過1W和2W的治療,所有藥物治療組小鼠的糞便卵囊量與陽性對照組相比,均明顯減少(P＜0.05),而且合劑治療組明顯低于單劑治療組(P＜0.05)。隨著治療時間的延長,藥物治療組C2、D2的排卵囊量分別低于C1、D1(P＜0.05)。雙氫青蒿素治療組D1、D2排卵囊量分別明顯低于補骨脂治療組C1、C2(P＜0.05)。見圖 1、表1。

表1 隱孢子蟲病鼠糞檢卵囊的變化Table 1 The number of oocysts in feces in mice infected with Cryptosporidium parvum

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 病理組織學(xué)觀察 1w治療組,A1組小腸絨毛整齊規(guī)則,上皮細胞及腺體結(jié)構(gòu)清晰;B1組小腸上皮有缺損樣改變,結(jié)構(gòu)不完整,可見大量炎性細胞和淋巴細胞浸潤;C1組小腸黏膜組織仍可見少量壞死灶,腺體排列較整齊,回腸充血,固有層有大量的炎癥細胞浸潤;D1組小腸黏膜組織修復(fù)中,出現(xiàn)的壞死區(qū)域變小或減少;E1組小腸黏膜上皮及腺體結(jié)構(gòu)逐漸完整,壞死灶少見。

2w治療中,A2組小腸絨毛結(jié)構(gòu)正常,上皮細胞完好;B2組上皮細胞缺損,細胞排列不整,空腸部分腸黏膜已脫落呈火山口狀;C2組黏膜組織壞死恢復(fù),壞死灶少見;D2組黏膜恢復(fù)較好,腺體及上皮排列整齊;E2組小腸絨毛結(jié)構(gòu)及腺體完好,恢復(fù)較好。

2.2.2 掃描電鏡觀察 正常對照組:A1和A2組均可見微絨毛完整,排列整齊、緊密,無脫落現(xiàn)象。

陽性對照組:B1組可見隱孢子蟲滋養(yǎng)體似圖釘樣深嵌于微絨毛叢內(nèi),蟲體大小不一。微絨毛較為完整,無倒伏,萎縮和脫落現(xiàn)象;B2組可見小腸上皮細胞寄生有大量的蟲體,球形或橢球形,呈現(xiàn)出微絨毛脫落、倒伏,排列紊亂現(xiàn)象,蟲體周圍微絨毛叢稀疏,有些甚至找不到微絨毛。上皮細胞大量增殖壞死。

治療組:補骨脂治療C1組可見小腸微絨毛完整,無倒伏,但仍有少量蟲體寄生于完整的微絨毛從中;C2組中寄生的蟲體大小不等,數(shù)量很少,微絨毛無脫落現(xiàn)象。雙氫青蒿素治療組D1可見寄生蟲體極少,所見蟲體大小均勻一致,蟲體周圍的微絨毛完整,排列整齊;D2組沒發(fā)現(xiàn)蟲體,微絨毛排列整齊。合劑治療組E1可見微絨毛整齊,偶見1蟲體,形態(tài)不規(guī)則;E2組沒找到蟲體,微絨毛完整。見圖2。

2.2.3 透射電鏡觀察 正常對照組:A1和A2組均可見小腸絨毛上皮細胞形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,大小一致。細胞邊緣清晰整齊,細胞連接緊密。表面有大量的微絨毛,排列整齊,分布均勻。

陽性對照組:B1組可見上皮細胞遭到破壞,形狀不規(guī)則,細胞連接不整齊,可見細胞腫脹,有些細胞呈短柱狀。細胞排列不整,杯狀細胞減少;B2組上皮細胞腫脹、微絨毛稀疏、倒伏,并出現(xiàn)斷裂和脫落嚴重等病征。可見小鼠隱孢子中期滋養(yǎng)體嵌于腸上皮細胞的刷狀緣,細胞膜下,細胞質(zhì)外。

治療組:與模型組B1相比,3個治療組C1、D1、E1的小鼠小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)均未見微絨毛倒伏,斷裂,脫落;與 B2相比,治療組 C2、D2、E2 小腸上皮細胞狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn),細胞排列趨于整齊。細胞連接復(fù)合體正常,細胞連接未見松散,見圖3。

圖1 隱孢子蟲卵囊(CP)(糞便,改良抗酸染色 ×1 000)Fig1 C.parvum oocysts(feces,modified acid fast stain ×1 000)

圖2 各組掃描電鏡結(jié)果Fig.2 Result of scanning electron microscope

4 討 論

中藥補骨脂是豆科植物補骨脂的干燥成熟果實,性溫,味辛,具有溫腎助陽、納氣、止瀉等功效〔1〕,是臨床常用藥。崔昱等〔2-3〕用補骨脂與鴉膽子合劑治療大鼠卡氏肺孢子蟲肺炎,結(jié)果表明補骨脂可明顯提高宿主免疫力,有較強的抵抗氧自由基作用。很多科學(xué)實驗也證實了補骨脂可提高小鼠特異性體液免疫以及機體非特異性免疫力及應(yīng)激態(tài)小鼠體液免疫〔4-5〕。青蒿素為菊科黃花蒿植物的提取物,能殺滅瘧原蟲,治療瘧疾,還可治療弓形蟲病、血吸蟲病、卡氏肺孢子蟲肺炎等〔6-9〕。雙氫青蒿素(Dihydroarteannuin,DHA)為青蒿素類在體內(nèi)最終的有效形式,也有調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用〔10〕,有學(xué)者實驗證實DHA可通過作用于陰道毛滴蟲微絲結(jié)構(gòu),破壞其結(jié)構(gòu)和功能,達到抑殺蟲,清除感染的目的〔11〕;DHA還可對藍氏賈第鞭毛蟲的質(zhì)膜及細胞骨架產(chǎn)生較強的損傷作用,達到抑殺蟲體的目的〔12〕;而隱孢子蟲的細胞骨架蛋白在蟲體的運動和侵入宿主的過程中發(fā)揮重要作用〔13〕。因此,我們可利用DHA藥學(xué)機制來控制隱孢子蟲的感染及防止疾病的發(fā)生。

圖3 各組透射電鏡結(jié)果Fig.3 Result of transmission electron microscope

本實驗研究通過對隱孢子蟲感染小鼠中藥治療前后體質(zhì)變化、卵囊排出量以及腸壁黏膜組織病理及超微結(jié)構(gòu)變化動態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)中藥補骨脂、雙氫青蒿素以及二者合劑組對隱孢子蟲病的治療效果是令人滿意的。在抑殺蟲效果方面,合劑治療組優(yōu)于單劑治療組;雙氫青蒿素組優(yōu)于補骨脂組;2w組優(yōu)于1w組,表明較長時間的穩(wěn)定持續(xù)治療明顯有助感染控制及免疫應(yīng)答反應(yīng)能力的提高。陽性對照組的小腸,在15 000,20 000倍掃描電鏡下觀察,可見上皮細胞有大量蟲體寄生,呈球形或橢球形的蟲體似圖釘樣寄居于微絨毛叢中,大量蟲體覆蓋于小腸微絨毛上皮的表面,溶噬腸壁黏膜,致使微絨毛倒伏、脫落,嚴重影響其營養(yǎng)的吸收。而與相應(yīng)的陽性對照組相比,所有治療小鼠黏膜上皮細胞處于修復(fù)之中,上皮細胞的細胞連接趨于整齊,微絨毛趨于直立及完整。盡管在1w治療組中尚存少量還沒有完全修復(fù)的病灶,并且在這些病灶中發(fā)現(xiàn)個別殘存的滋養(yǎng)體,其周圍的微絨毛已開始修復(fù)緊密、整齊,較少有倒伏、腫脹和脫落的現(xiàn)象。經(jīng)過2周后各治療組小鼠幾乎找不到隱孢子蟲的寄生,由此可見這兩種中藥對隱孢子蟲的感染和治療有較為明顯的療效,而且二者具有協(xié)同抑殺蟲體、提高機體免疫力,以抵御隱孢子蟲感染與致病的作用。

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