馬 銳,師志云,李昭宇,王婭娜,李宗吉,趙 巍

囊性包蟲病(cystic echinocoecosis,CE)是由細(xì)粒棘球蚴絳蟲(Echinococcus granulosus,Eg)幼蟲引起的一種人畜共患寄生蟲病,雖呈全球性分布,但主要流行于高原和氣候寒冷的畜牧業(yè)地區(qū),如亞洲,非洲,歐洲,北美洲、澳大利亞等〔1〕。據(jù) WHO 報(bào)告〔2〕:發(fā)病最為嚴(yán)重的北非突尼斯人群的發(fā)病率為1.5～2.05/10萬(wàn)。我國(guó)是包蟲病發(fā)病最高的國(guó)家之一,以疆、青、甘、寧、藏、內(nèi)蒙和川西較為嚴(yán)重。疫苗防治是控制包蟲病流行的最有效的方法〔3-4〕。本課題小組根據(jù)GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出細(xì)粒棘球蚴親肌肉抗原基因的已知序列并設(shè)計(jì)引物,通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆出目的基因,并在大腸埃希菌(E.coli)中表達(dá)重組蛋白(rEgmyophilin),研究證明原核表達(dá)的重組蛋白具有較好的抗原性和免疫原性〔5-6〕。本次研究以Egmyophilin為候選疫苗抗原分子免疫小鼠,細(xì)粒棘球蚴原頭蚴攻擊后觀察其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)力和抗體水平,為疫苗研制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6-8w齡雄性ICR小鼠,體重(18±2)g,共24只,購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 細(xì)粒棘球蚴原頭蚴 從寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科包蟲病患者手術(shù)摘除的完整包囊中無(wú)菌條件下抽取囊液,分離原頭蚴,經(jīng)PBS(pH7.2)洗滌3次后,棄去上清液,用0.5%伊紅染色計(jì)數(shù)原頭蚴的著色率及形態(tài),原頭蚴的存活率＞90%,用PBS配成1.5×104個(gè)原頭蚴/mL懸液,用于攻擊感染ICR小鼠。

1.1.3 細(xì)粒棘球蚴重組蛋白Egmyophilin:由本室構(gòu)建〔5-6〕。

1.1.4 主要試劑 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b IgG3和 IgE 購(gòu)自華美生物工程公司北京分公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及免疫 將ICR小鼠隨機(jī)分為蛋白免疫組和佐劑對(duì)照組,每組12只。兩組小鼠在0、2、4w各免疫1次,共 3次,第1次基礎(chǔ)免疫注射10 μ g rEgmyophilin和等量弗氏完全佐劑,以后 2次為加強(qiáng)免疫均用10 μ g rEgmyophilin和等量弗氏不完全佐劑。佐劑對(duì)照組免疫方案相同,只注射弗氏佐劑和PBS。兩組均采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫,每次注射量為 100μL/只。于 0、2、4、8w 從鼠尾各采血1次,將血液4 000 r/min離心 10 min,吸取血清,-85℃保存。

1.2.2 攻擊感染 第3次免疫后2w,蛋白免疫組和佐劑對(duì)照組每只小鼠用1 500個(gè)活棘球蚴原頭蚴腹腔內(nèi)注射進(jìn)行攻擊感染。攻擊感染20w后剖殺小鼠,眼球采血,分離血清。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),蛋白免疫組有2只小鼠死亡,佐劑對(duì)照組有3只小鼠死亡。

1.2.3 觀察免疫保護(hù)力指標(biāo)

1.2.3.1 免疫保護(hù)力 活棘球蚴攻擊感染20w后剖殺兩組小鼠,切開小鼠腹部,稱取小鼠脾臟,計(jì)算脾指數(shù),公式:脾指數(shù)=脾的重量(mg)/小鼠體重(g);計(jì)數(shù)肝臟及腸系膜處的棘球蚴包囊,根據(jù)Dempster〔7〕計(jì)算免疫保護(hù)力 ,公式:免疫保護(hù)力(%)=(1-免疫組平均包囊數(shù)/對(duì)照組平均包囊數(shù))×100%。

1.2.3.2 常規(guī)ELISA檢測(cè)IgG及其亞型和IgE抗體 用終濃度為10 μ g/mL rEgmyophilin—碳酸緩沖液(pH 9.6)包被96孔酶標(biāo)板,100μL/孔,4℃過(guò)夜;次日用PBS洗板3次,5%脫脂奶粉37℃封閉2 h;加1∶100稀釋的蛋白免疫組鼠血清,100μL/孔,37℃反應(yīng)2 h,PBS洗板3次;加入1∶1000稀釋的羊抗鼠 Ig-H RP 100μL/孔,37 ℃反應(yīng) 2 h,PBS洗板3次;加四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液,15 min后用2 mol/L H2SO4(50μL/孔)終止反應(yīng),用酶標(biāo)分析儀測(cè)定每孔A450值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析,組間比較用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 rEgmyophilin誘導(dǎo)小鼠抗包蟲感染的保護(hù)作用 蛋白免疫組和佐劑對(duì)照組的棘球蚴包囊平均直徑分別為0.8mm和7.8mm,包囊數(shù)目分別為0.74±2.10和7.83±17.21個(gè),同時(shí)rEgmyophilin免疫ICR小鼠可獲得94.46%的免疫保護(hù)力。

2.2 蛋白免疫組小鼠IgG及其亞型和IgE抗體檢測(cè)結(jié)果 蛋白免疫組小鼠血清IgG、IgG1和IgE水平,免疫后與免疫前相比均明顯增加(F=1456.48、6.99、49.84,P＜0.05),感染后小鼠血清 IgG、IgG1、IgG3和IgE水平與免疫前相比均明顯增加(P＜0.05),而感染后小鼠血清IgG3和IgE水平與免疫后相比明顯升高(F=24.59、49.84,P＜0.05);與免疫前相比,小鼠血清IgG2b在感染后明顯降低(F=7.09,P＜0.05),感染后小鼠血清IgG2b水平與免疫后相比明顯降低(P＜0.05);與免疫前相比,小鼠血清IgG2a在免疫后和感染后無(wú)明顯變化(F=0.74,P＞0.05,表1)。

表1 rEgmyophilin免疫前、后和攻擊感染后小鼠血清抗體檢測(cè)( ,n=8)Table 1 Detection on immunoglobulin in sera of mice vaccinated with rEgmyophilin after challenge infection(,n=8)

表1 rEgmyophilin免疫前、后和攻擊感染后小鼠血清抗體檢測(cè)( ,n=8)Table 1 Detection on immunoglobulin in sera of mice vaccinated with rEgmyophilin after challenge infection(,n=8)

注:與免疫前比較,*P＜0.05;與免疫后比較,△P＜0.05

組別 免疫前(0w) 免疫后(8w) 感染后(20w) F P IgG 0.0220±0.0163 1.1369±0.0254* 1.5250±0.1451*△ 1456.48 0.000 IgG1 0.2149±0.0095 1.3061±0.1516* 1.4994±0.9128* 6.99 0.003 IgG3 0.0914±0.0155 0.0951±0.0175 0.3731±0.0166*△ 24.59 0.000 IgG2a 0.1140±0.0353 0.3286±0.6591 0.5043±0.7894 0.74 0.395 IgG2b 0.1543±0.0167 0.2057±0.1140 0.0627±0.0395*△ 7.09 0.001 IgE 0.0247±0.0006 0.0682±0.0103* 0.0891±0.0228*△ 49.84 0.000

3 討 論

寄生蟲的體液免疫方面,眾多學(xué)者研究的比較多的是 IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 及 IgE 等。AI-Qaoud等〔8〕用抗原 B(EgAgB)免疫 Balb/c小鼠,其減蚴率為98.3%,且從免疫后的1月直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(7月)所有IgG亞型都是逐漸升高的。B抗原是較好的診斷抗原,是與包蟲病免疫逃逸機(jī)制有關(guān)的抗原,在感染Eg的羊和小鼠體內(nèi),宿主的IgG和包囊壁相結(jié)合,構(gòu)成宿主免疫屏障來(lái)完成免疫逃逸,因此,體液免疫指標(biāo)可提高對(duì)CE的診斷效率及反映免疫逃逸的機(jī)制。Woollard等〔9〕將4種Eg95合成肽加用或不用弗氏佐劑肌肉注射免疫6～12月齡綿羊2次后發(fā)現(xiàn)第1次免疫后 3周羊血清抗Eg95的IgG2水平升高,持續(xù)1年以上,該抗體在體外可殺傷Eg蟲卵的六鉤蚴,提示IgG抗體參與了Eg95誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫,并且認(rèn)為保護(hù)力主要是由抗體介導(dǎo)的。林勇等〔10〕將 100μ g的 pCD-Eg95皮下注射Balb/c小鼠5次,在免疫后4～10w發(fā)現(xiàn)鼠血清 IgG升高,在免疫后 2～10w發(fā)現(xiàn)鼠血清IgG2a增加;丁劍冰等〔11〕將 50μ g Eg95 重組蛋白加弗氏佐劑皮下注射免疫Balb/c小鼠4次后發(fā)現(xiàn)第1次免疫后2w抗Eg95的IgG升高,且免疫后6～8w達(dá)最高水平,滴度可達(dá)1∶25 600。目前的研究結(jié)果顯示用活的蟲卵或者六鉤蚴免疫小鼠主要產(chǎn)生IgG1和IgG3亞型〔12〕。本實(shí)驗(yàn)將 rEgmyophilin免疫小鼠,原頭蚴攻擊后發(fā)現(xiàn)小鼠血清IgG、IgG1、IgG3和IgE在免疫后以及感染后顯著增加;IgG2a水平增加不明顯,IgG2b水平先增加后降低,表明rEgmyophilin能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫反應(yīng),提示 IgG、IgG1、IgG2b和 IgE抗體在抗包蟲感染過(guò)程中可能起重要作用,其保護(hù)性免疫機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

程寧等〔12〕用1mg的Eg囊液抗原和原頭節(jié)抗原加弗氏佐劑分別皮下注射免疫昆明種小鼠3次,首次免疫后4周用4000個(gè)Eg原頭節(jié)進(jìn)行攻擊感染,感染后28w剖殺各組小鼠發(fā)現(xiàn)Eg囊液抗原組和原頭節(jié)抗原免疫組的減蚴率分別為51.70%和77.10%,證明免疫的方法可以用于防止包蟲蚴蟲的感染。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)在成功制備大量純化 rEgmyophilin蛋白的基礎(chǔ)上,用該重組蛋白免疫ICR小鼠,相對(duì)于佐劑對(duì)照組可獲得94.46%的免疫保護(hù)力,免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗體水平,初步認(rèn)為rEgmyophilin作為疫苗候選抗原具有一定的潛在價(jià)值。

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