陳 姍,馬長玲,高志巖,麥璟瑩,趙晶晶,朱郇憫,李小敏,李 孜

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族成員在細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成和免疫調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用〔1-8〕。TβR(TGF-β受 體)有多 種,其 中 I 型(TβRI)、II型(TβRII)、III型(TβRIII)分布于多類細(xì)胞膜上。TβRI和 TβRII在 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主導(dǎo)作用,TβRII具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,在生理濃度下可單獨(dú)與 TGF-β結(jié)合,結(jié)合后TβRII胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,再與 TβRI結(jié)合形成 TGF-β-TβRII-TβRI復(fù)合體,隨之 TβRI胞內(nèi)段發(fā)生磷酸化,引起下游smad蛋白家族的一系列變化,從而將信號(hào)傳遞于細(xì)胞胞核內(nèi)〔9-10〕,調(diào)控目的基因表達(dá)。

Osman等在曼氏血吸蟲發(fā)現(xiàn)了 TβRII(SmTβRII),該基因大約為26kb,由9個(gè)外顯子組成。序列比對(duì)表明,SmTβRII與哺乳動(dòng)物(大鼠,小鼠,人)活性TβRII有一定的同源性。應(yīng)用siRNA技術(shù),沉默SmTβRII,可引起抱雌溝蛋白(Gynecophoral canal protein,GCP)表達(dá)減少,表明SmTβRII通過激活 TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)GCP表達(dá),提示TGF-β信號(hào)通路在雄蟲促雌蟲發(fā)育成熟方面起著重要作用〔11〕。在此基礎(chǔ)上我們推測(cè)日本血吸蟲亦有可能存在 TβRII(SjTβRII),在蟲體自身發(fā)育和對(duì)宿主致病過程中發(fā)揮重要作用。本文通過RACE方法,獲得日本血吸蟲 TβRII樣基因全長cDNA序列,在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,克隆、原核表達(dá)其N端(即胞外段),為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 E.coil BL21(DE3)菌種、原核表達(dá)載體pET28a(+)質(zhì)粒均由本教研室保存,pMD19-T Vector購自TaKaRa公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和釘螺 新西蘭大白兔購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,陽性釘螺(Oncomelaniahupensis)購自江西省血吸蟲病防治研究所。

1.1.3 主要試劑 T RIzol試劑購自Invitrogen公司,Taq DNA聚合酶、RT-PCR試劑盒、Marker DL2000、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、蛋白質(zhì)低分子量標(biāo)準(zhǔn)均購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒及DNA膠回收純化試劑盒購自美國Axygen公司,His·Tag融合蛋白純化試劑盒購自QIAGEN公司,HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 日本血吸蟲成蟲總RNA的提取 按常規(guī)方法〔12〕尾蚴感染新西蘭大白兔,45d后剖殺,收集成蟲,抽提總RNA并測(cè)定其濃度、純度。置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) Sj TβRII樣基因cDNA全長序列由英濰捷基生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)應(yīng)用RACE方法獲得。根據(jù)所獲得的序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增其全長的特異性引物,引物 1:GTCGAGCTCATGGAATGCTAT TGTACACC,含 Sac I酶切位點(diǎn),引物2:GCCAAGCT TTGATCACTGAAAGTTAGGTA,含 Hind III酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增SjTβRII樣基因胞外段的引物:上游引物同引物1,引物3:CGGAAGCT TGAT TAT TGGAGCTGT TATTA ,含Hind III酶切位點(diǎn),以上引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.3 Sj TβRII樣基因的 RT-PCR擴(kuò)增、TA克隆及序列測(cè)定 將日本血吸蟲成蟲RNA逆轉(zhuǎn)錄,以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,用擴(kuò)增其全長的特異性引物進(jìn)行PCR:94℃預(yù)變性5 min后,熱循環(huán)參數(shù)為94℃45 s,61℃45 s,72℃2 min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。純化后的PCR產(chǎn)物按pMD19-T Vector試劑盒說明書,克隆入載體pMD19-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取陽性克隆,進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。通過在線 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫,跨膜結(jié)構(gòu)分析工具TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)、SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)對(duì)所獲得的cDNA序列及其氨基酸序列進(jìn)行綜合分析。

1.2.4 Sj TβRII樣基因胞外段(Sj TβRII-like-N)的原核表達(dá)、蛋白純化 以成功構(gòu)建的SjTβRII樣基因的 TA克隆質(zhì)粒為模板,以引物1、3行PCR,定向克隆入pET28a(+),對(duì)篩選的克隆進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。陽性克隆菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5h后收集菌液,按常規(guī)方法行SDS-PAGE電泳分析〔13〕。

按上述方法對(duì)重組菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),收集包涵體沉淀,用8 mol/L的尿素溶解變性后,離心收集上清。將上清過Ni離子親和層析柱,用含1 mol/L咪唑的洗脫液洗脫并收集。純化的蛋白透析之后取少量樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析,并測(cè)定濃度。

1.2.5 SjTβRII樣基因胞外段蛋白多克隆抗體的制備及其效價(jià)的測(cè)定 按常規(guī)方法〔14〕將純化的目的蛋白免疫SD大鼠(200 μ g/只)。第1次免疫前采大鼠血并分離血清作為正常大鼠血清,末次免疫后10 d采血分離血清,以免疫前的大鼠血清作為陰性對(duì)照,ELISA法測(cè)定免疫大鼠血清抗體效價(jià)。

1.2.6 Western blotting鑒定 SjTβRII樣基因胞外段蛋白 取純化的重組蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE,電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜,用免疫Sj TβRII樣基因胞外段蛋白大鼠血清識(shí)別(按1∶2 500稀釋),同時(shí)以免疫前的正常大鼠血清(按1∶2 500稀釋)為陰性對(duì)照,以HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體作為第二抗體(按1∶5 000稀釋),進(jìn)行Western blotting 分析〔13〕。

2 結(jié) 果

2.1 日本血吸蟲Sj TβRII樣基因的 RT-PCR擴(kuò)增、TA克隆及鑒定 應(yīng)用引物1、2,以成蟲總 RNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得約2 300bp特異條帶,與預(yù)期分子量大小一致。將構(gòu)建的TA克隆重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定,與目的基因條帶相符,測(cè)序結(jié)果表明該序列與Invitrogen公司應(yīng)用 RACE方法獲得的SjTβRII樣基因cDNA序列完全一致。此序列已獲得NCBI登錄號(hào):FJ753578。

2.2 Sj TβRII樣基因的生物信息學(xué)分析SjTβRII樣基因cDNA 全長2283 bp,編碼760個(gè)氨基酸,蛋白的理論分子量為86.488 kDa,等電點(diǎn)為6.47。經(jīng)軟件分析其aa259-aa559具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性,確定aa1-aa144氨基酸位于胞外段,aa144-aa157氨基酸位于跨膜段,aa157-aa760氨基酸位于胞內(nèi)段,不含有信號(hào)肽序列。

同源性分析發(fā)現(xiàn)Sj TβRII樣基因氨基酸序列與曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni,S.m)TβRII(GenBank登錄號(hào):AAV67030.1)、多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis,E.m)TβRII(Gen-Bank登錄號(hào):CAQ76822.1)、紅原雞(Gallus gallus,G.g)TβRII(GenBank登錄號(hào):NP_990759.1)、黑猩猩(Pan troglodytes,P.t)TβRII(GenBank登錄號(hào):XP_001166647.1)、小鼠(Mus musculus,M.m)TβRII(GenBank 登錄號(hào):AAH52629.1)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata,T.g)TβRII(GenBank登錄號(hào):XP_002195667.1)、人(Homo sapiens,H.s)TβRII(GenBank登錄號(hào) :AAA61164.1)、斑馬魚(Danio rerio,D.r)TβRII(GenBank 登 錄 號(hào):AAI65315.1)的氨基酸序列一致性分別是70.7%、28.6%、18.4%、18.3%、18.1%、17.9%、17.9%、17.8%。因?yàn)樯形磳?duì)所獲得的基因做功能研究,故暫命名為Sj TβRII樣基因。

應(yīng)用Vector NTI軟件對(duì)9個(gè)物種 TβRII的氨基酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化樹的構(gòu)建,見圖1,結(jié)果顯示日本血吸蟲SjTβRII樣基因和曼氏血吸蟲TβRII源于同一祖先,與人、鼠的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖1 日本血吸蟲T βRII樣基因與其它物種T βRII的分子進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analyses SjT β RII-like gene with T β RII from other species

2.3 SjTβRII樣基因胞外段克隆及蛋白表達(dá)、純化將構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒分別經(jīng)PCR、雙酶切鑒定,均出現(xiàn)與目的基因相符的條帶,同時(shí)測(cè)序結(jié)果亦表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,12%SDS-PAGE顯示分子量約在22 kDa處出現(xiàn)一明顯蛋白條帶,而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在誘導(dǎo)前后以及重組質(zhì)粒工程菌在誘導(dǎo)前均無此蛋白條帶的出現(xiàn),表明此蛋白條帶為目的蛋白條帶,見圖2。菌體裂解上清中未見該蛋白條帶的出現(xiàn),提示該蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)8 mol/L尿素變性溶解后,將溶解上清經(jīng)過Ni離子親和層析柱,在不同低濃度咪唑梯度漂洗后,用1 mol/L咪唑洗脫,獲得分子量約22kDa的較單一蛋白。

圖2 SjT βRII樣基因胞外段原核表達(dá)及純化產(chǎn)物的SDSPAGE鑒定1.未誘導(dǎo)的含空載體 pET28a(+)的菌體蛋白;2.誘導(dǎo)的含空載體pET28a(+)的菌體蛋白;3.未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒pET28a-SjTβ RII-like-N的菌體蛋白;4.誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的菌體蛋白;M,蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物;5.純化后的目的蛋白Fig.2 Expression and purification of SjTβRII-like-N1,BL21 cell containing pET-28a(+)without IPTG induction;2,BL21 cell containing pET28a(+)with IPTG induction;3,BL21 cell containing pET28a-SjTβ RII-like-N without IPTG induction;4,BL21 cell containing pET28a-SjTβ RII-like-N with IPTG induction;M,protein molecular marker(masses shown on the right side);5,pET28a-SjTβRII-like-N recombinant proteins purified by the affinity purification method

2.4 Western-blotting鑒定SjTβRII樣基因胞外段重組蛋白 用ELISA方法測(cè)定免疫SjTβRII樣基因胞外段重組蛋白大鼠血清效價(jià)約為1∶10 000。免疫重組蛋白的大鼠血清對(duì)純化蛋白的 Western Blotting顯示出清晰的條帶,陰性對(duì)照未見條帶(圖3)。

3 討 論

大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí) TβRI和TβRII在 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主導(dǎo)作用。在抗 TGF-β的生長抑制作用的MvlLu突變細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),沒有 TβRII,TβRI不能結(jié)合 TGF-β;沒有 TβRI時(shí) ,TβRII則不能傳遞TGF-β的信號(hào)〔9-10〕。日本血吸蟲對(duì)宿主的致病主要是其引起的肝臟蟲卵肉芽腫及其纖維化病變,而 TGF-β1是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的肝纖維化促進(jìn)因子之一〔15〕,因此獲得 SjTβRII基因序列是研究蟲體TβR所介導(dǎo)的TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo)通路在日本血吸蟲致病方面的基礎(chǔ)。另外,鑒于曼氏血吸蟲的TβRII可誘導(dǎo)抱雌溝蛋白GCP表達(dá),從而在雄蟲促雌蟲發(fā)育成熟方面所起的重要作用〔11〕,提示TβRII可作為疫苗候選分子。

圖3 SjTβRII樣基因胞外段純化產(chǎn)物被該蛋白免疫的大鼠血清識(shí)別M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物;1:免疫大鼠血清;2:免疫前大鼠血清Fig.3 Purification of pET28a-SjT βRII-like-N recognized by antisera of SD ratM:protein mark;1:the purified product of pET28a-SjTβRII-like N reacted with immune serum of SD rat;2:the purified product of pET28a-SjTβ RII-like-N reacted with normal serum of SD rat.

通過RACE方法,本文首次獲得了日本血吸蟲TβRII樣基因全長cDNA序列,通過生物信息學(xué)分析,其 cDNA 全長2 283bp,編碼 760個(gè)氨基酸,具有TβRII保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與曼氏血吸蟲TβRII氨基酸序列高度同源,而與宿主小鼠、人的TβRII氨基酸等同源性低,尤其是胞外段氨基酸序列,與小鼠和人的相應(yīng)序列一致性僅為8.5%,因此,本實(shí)驗(yàn)克隆、原核表達(dá)日本血吸蟲TβRII樣基因胞外段,以進(jìn)一步研究其是否可作為日本血吸蟲疫苗的靶分子。

本文成功構(gòu)建了日本血吸蟲的TβRII樣基因胞外段原核表達(dá)載體,并獲得了高效表達(dá),但表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在,經(jīng)變性處理后的親和層析純化,可得到較純的重組蛋白。免疫大鼠可獲得高效價(jià)的免疫血清,Western blotting結(jié)果表明該蛋白具有較強(qiáng)的線性表位,上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究Sj TβRII樣基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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