韓紅蕾 張連山 顧鳳明

正常和膜迷路積水豚鼠內(nèi)耳水通道蛋白的表達及意義

韓紅蕾1張連山2顧鳳明3

目的 檢測正常和膜迷路積水豚鼠內(nèi)耳水通道蛋白（aquaporins，AQPs）的表達，探討其機理和意義。方法 20只健康豚鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只，實驗組（膜迷路積水模型組）豚鼠腹腔注射醋酸去氨加壓素，4μg·kg－1·d－1，共1周，誘導(dǎo)其內(nèi)耳膜迷路積水，對照組豚鼠腹腔注射等量生理鹽水。用免疫組化方法檢測兩組豚鼠內(nèi)耳水通道蛋白的表達，并進行比較。結(jié)果 對照組豚鼠內(nèi)耳中有AQP0、1、2、3、5、7、8的表達，其中AQP0僅在血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞有較弱的表達；AQP1分布于包繞骨迷路、內(nèi)淋巴囊、內(nèi)淋巴管的纖維細胞，基底膜鼓階面細胞、螺旋韌帶纖維細胞、螺旋緣纖維細胞、Corti’s器、內(nèi)外螺旋溝、血管紋、橢圓囊壁、球囊壁、螺旋神經(jīng)節(jié)等；AQP2表達在血管紋、Corti’s器、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)淋巴囊中；AQP3、7、8三者的分布類似，在螺旋神經(jīng)節(jié)和包繞膜迷路的組織中表達，包括Corti’s器、內(nèi)外螺旋溝、血管紋、螺旋韌帶纖維細胞、螺旋緣、橢圓囊壁、球囊壁、內(nèi)淋巴囊等；AQP5則表達在Corti’s器、內(nèi)外螺旋溝、螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋韌帶纖維細胞。實驗組豚鼠內(nèi)耳中，血管紋AQP2的表達與對照組較正常豚鼠表達增加，其它亞型AQPs的表達與對照組無明顯差異。結(jié)論 正常豚鼠內(nèi)耳中有多種AQPs表達，膜迷路積水后豚鼠內(nèi)耳中AQP2的表達增強，提示膜迷路積水可能與AQP2表達上調(diào)有關(guān)。

水通道蛋白； 膜迷路積水； 醋酸去氨加壓素； 豚鼠

梅尼埃病的病理基礎(chǔ)是膜迷路積水，但其發(fā)病機理仍不清楚。水通道蛋白（aquaporins，water channel protein，AQPs）是一種膜通道蛋白家族，負責(zé)生物體內(nèi)多種組織和細胞的水的快速跨膜轉(zhuǎn)運。目前的多種研究表明［1］，水通道蛋白對生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要的作用，其數(shù)量、結(jié)構(gòu)或功能的異常與多種病理和生理異常有關(guān)，但水通道蛋白與膜迷路積水之間的關(guān)系，目前尚無定論。國內(nèi)外的相關(guān)研究表明，內(nèi)耳結(jié)構(gòu)中有多種水通道蛋白亞型的表達，可能在膜迷路積水中起著一定的作用［2，3］。為探討水通道蛋白和膜迷路積水的關(guān)系，本研究觀察并分析了正常和膜迷路積水豚鼠內(nèi)耳AQPs的表達及其意義，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康白色紅目豚鼠20只購自北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心，雌雄不限，體重200～300 g，活動敏捷，耳廓反射靈敏。將豚鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只。動物的飼養(yǎng)和管理均符合北京市實驗動物管理規(guī)定。

1.2 實驗試劑及儀器 醋酸去氨加壓素（彌檸，Desmin）購自瑞典輝凌（Ferring）制藥有限公司，批號為CD6580S，批準(zhǔn)文號為X20010203。SP免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。AQP1、2抗體購自美國Chemicon試劑公司，AQP0、1、3、5、7、8抗體由美國Mayo醫(yī)學(xué)院Chen Xianming博士惠贈。

切片機（德國LEICA RM2145），奧林巴斯生物顯微鏡（美國BX51），數(shù)顯調(diào)恒溫水箱（北京長風(fēng)儀器儀表公司，浙制0281028），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司DHG－9030A），水浴機（北京市百姓佳商貿(mào)有限公司SY－1型）。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及取材 實驗組每日給予去氨加壓素4μg／kg－1·d－1，腹腔注射，共1周，以造成膜迷路積水的模型；對照組每日給予等量生理鹽水腹腔注射，共1周。停藥1周后，同時處死2組動物，取材。方法如下：將豚鼠全身麻醉后，快速開胸，暴露心臟，自心尖插入注射器針頭并固定之，取血1 ml，離心，取血清備用。剪開右心耳，依次用溫生理鹽水和4%的多聚甲醛快速灌注至豚鼠頸項強直、四肢僵硬，斷頭，快速打開聽泡，取出顳骨，打開前庭窗，在蝸尖和圓窗處各鉆一小孔后，將顳骨標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定。48 h后，將耳蝸標(biāo)本脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，沿平行于蝸軸的平面切片，每片厚3μm，每隔5片取2片，行免疫組化染色，每個標(biāo)本取20片。取出豚鼠顳骨后，取其心、肝、腎和肺，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。

1.3.2 血清學(xué)檢測及HE染色 用間接電極法檢測血清中K＋、Na＋、Ca2＋和Cl－的濃度。耳蝸及上述臟器切片常規(guī)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察造模情況。

1.3.3 SP法免疫組化染色 嚴格按試劑盒說明操作，分別以兔抗大鼠多克隆抗體AQP0、1、2、3、5、7、8檢測，其中AQP1、2、3、7均用豚鼠腎臟作為陽性對照，以腎小管上皮細胞胞漿中出現(xiàn)的褐色染色為陽性表現(xiàn)。所有實驗均以PBS代替一抗做陰性對照，根據(jù)著色深淺判斷表達強度。

1.3.4 造模成功即膜迷路積水的評估 正常情況下，耳蝸Reissner膜與前庭膜夾角大約為30°，Reissner膜將基底膜以上空間分為前庭階和蝸管兩部分，蝸管橫截面積約為基底膜以上空間的三分之一。膜迷路積水時，Reissner膜向前庭階方向膨隆，蝸管橫截面積增加。本研究將實驗動物膜迷路積水的程度粗略地分為三度，輕度：蝸管面積約占前庭階、蝸管總面積的1／3～1／2；中度：蝸管面積約占前庭階、蝸管總面積的1／2～2／3；重度：蝸管面積約占前庭階、蝸管總面積2／3以上。

采用Image－Pro Plus 6.0分析軟件系統(tǒng)分別計算橫貫豚鼠耳蝸軸的切片的第2、3、4回的蝸管橫截面積和蝸管加前庭階橫截面積，計算兩者之比并取其平均值作為該平面的蝸管與蝸管加前庭階的面積比（R），計算同一標(biāo)本的所有平面的R值并取均值作為這一標(biāo)本的平均R值，進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件包，對數(shù)據(jù)進行秩和檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)結(jié)果 實驗組和對照組豚鼠血清中K＋、Na＋、Ca2＋、Cl－的濃度差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。說明醋酸去氨加壓素在誘導(dǎo)膜迷路積水的過程中，對豚鼠血清中電解質(zhì)無明顯影響。

表1 兩組豚鼠血清中部分電解質(zhì)的濃度

表1 兩組豚鼠血清中部分電解質(zhì)的濃度

組別Ca2＋Cl－K＋Na＋對照組9.32±1.11 98.34±4.10 6.537±0.42 122.5±8.09實驗組9.11±0.94 98.33±4.24 6.523±0.36 127.33±5.15

2.2 膜迷路積水造模結(jié)果 兩組豚鼠的心、肺、肝和腎組織均無明顯充血水腫。對照組豚鼠內(nèi)耳Re-issner膜平直無膨隆，前庭階、鼓階、蝸管和內(nèi)淋巴囊均無結(jié)構(gòu)異常。實驗組中，有6只豚鼠出現(xiàn)膜迷路積水，積水始于耳蝸底回，表現(xiàn)為耳蝸2、3、底回Reissner膜不同程度地膨向前庭階，部分Reissner膜有破裂；其中有2只豚鼠為輕度膜迷路積水，3只為中度膜迷路積水，1只為重度膜迷路積水（圖1）。造模過程中，有2只豚鼠在用藥5天后出現(xiàn)行動較緩慢，平衡不穩(wěn)，停藥2天后好轉(zhuǎn)。實驗組與對照組的R值也有明顯差異（P＝0.000＜0.05）（表2）。

表2 兩組豚鼠耳蝸蝸管、蝸管加前庭階橫截面積（像素數(shù)pix）及二者之比（R值

表2 兩組豚鼠耳蝸蝸管、蝸管加前庭階橫截面積（像素數(shù)pix）及二者之比（R值

注：*與對照組相比較，P＜0.05

組別蝸管面積蝸管加前庭階面積R值對照組130.24±28.55 395.37±97.42 0.33±0.03實驗組141.46±31.23 329.83±79.97 0.43±0.09*

圖1 ：實驗組豚鼠耳蝸（HE×100）

圖5 對照組豚鼠耳蝸AQP5的表達（SP×200）

圖4 對照組豚鼠耳蝸AQP8的表達（SP×200）

圖2 對照組耳蝸AQP1的表達（SP×200）

圖3 AQP2在對照組耳蝸血管紋的表達（SP×200）

圖6 實驗組豚鼠血管紋AQP2的表達（SP×200）

2.3 免疫組化結(jié)果 對照組豚鼠內(nèi)耳中，各型AQP均有表達：①AQP0僅在血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞有較弱的表達；②AQP1的分布最廣泛，既見于包繞骨迷路的組織，如：骨迷路周圍纖維細胞、基底膜鼓階面細胞、包繞內(nèi)淋巴囊及內(nèi)淋巴管的纖維細胞等，也見于包繞膜迷路的組織中，包括Corti器、內(nèi)外螺旋溝、血管紋、螺旋韌帶纖維細胞、螺旋緣、橢圓囊壁、球囊壁等，還見于螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、顳骨骨質(zhì)中的毛細血管等，同時AQP1的表達最強，尤其在與骨質(zhì)相接觸的纖維細胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞（圖2）；③AQP2表達血管紋、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)淋巴囊中（圖3）；④AQP3、7、8在Corti器、內(nèi)外螺旋溝、血管紋、螺旋韌帶纖維細胞、螺旋緣、橢圓囊壁、球囊壁、內(nèi)淋巴囊等以及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞中均有表達，其中，在Corti器、內(nèi)外螺旋溝、血管紋以及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞表達較強（圖4），同時，AQP3、7在Reissner膜也有較弱表達；⑤AQP5在Corti器、內(nèi)外螺旋溝、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞表達較強（圖5），在螺旋韌帶纖維細胞表達略弱。實驗組豚鼠內(nèi)耳中AQP0、1、3、5、7、8的表達部位和強度均與對照組相同，AQP2表達的部位也與對照組相同，但在血管紋表達的強度明顯增加（著色明顯加深）（圖6）。

3 討論

建立膜迷路積水動物模型的方法有多種，如栓塞法、免疫法、毒素法、激素法等。鑒于臨床梅尼埃病患者發(fā)病時有抗利尿激素（antidiuritic hormone，ADH）升高的表現(xiàn)，國外學(xué)者嘗試用ADH誘導(dǎo)膜迷路積水，Takeda等［4］通過在豚鼠皮下植入微泵，緩慢持續(xù)給予ADH造成豚鼠耳蝸底回、中回甚至頂回的輕中度積水，但皮下植入微泵操作相對復(fù)雜。本研究改用腹腔注射的方法，同時為了減少ADH升高血壓的作用，采用了ADH的類似物——醋酸去氨加壓素。該藥品為天然激素——精氨酸加壓素的類似物，其結(jié)構(gòu)改良為：把（1）位置上的半胱氨酸脫氨，并以8－D－精氨酸代替8－L－精氨酸，改良后其抗利尿作用更加強大，加壓作用減弱。從文中結(jié)果看，在實驗組豚鼠中60%（6／10）產(chǎn)生了膜迷路積水，而且豚鼠血清中鉀、鈉、鈣、氯濃度沒有明顯變化，心、腦、肺、腎也沒有明顯的病理變化，說明醋酸去氨加壓素在誘導(dǎo)豚鼠膜迷路積水的同時，對豚鼠的主要臟器和電解質(zhì)無明顯影響，可以作為膜迷路積水動物造模藥物選擇。

國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)研究了動物內(nèi)耳水通道蛋白的表達。Beitz［2］用RT－PCR的方法，檢測了大鼠血管紋、內(nèi)淋巴囊、Reissner膜、前庭和Corti器的AQP1～5的表達，發(fā)現(xiàn)AQP1在上述各組織中均存在，可能是“看家蛋白”，AQP2、3和4見于內(nèi)淋巴囊，AQP5只表達于Reissner膜和柯替氏器；提示大鼠內(nèi)淋巴囊中存在細胞水通透系統(tǒng)，該系統(tǒng)可能與腎臟集合管主細胞中的水通透系統(tǒng)類似。黃德亮等［5］通過RT－PCR方法發(fā)現(xiàn)AQP1、3、4、7、9在成年小鼠的耳蝸、前庭和內(nèi)淋巴囊，均有較強表達，AQP5則只在耳蝸和內(nèi)淋巴囊中有較弱表達，未見AQP2表達；斑點雜交表明成年小鼠內(nèi)耳中AQPs的含量多少依次為：AQP4＞AQP1＞AQP3＞AQP5，提示可能各亞型水通道蛋白在內(nèi)淋巴的循環(huán)和穩(wěn)定中起著各自的作用，他們相互協(xié)調(diào)，共同維持內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。近幾年研究表明，人類的內(nèi)耳中，也存在不同類型AQPs的表達［6，7］，從而提出了將AQP作為治療梅尼埃病的新靶點的觀點［8］。

在本研究前期工作中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)豚鼠內(nèi)耳中有AQPs各亞型的表達［9］，本研究再次證實了該結(jié)論。在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)醋酸去氨加壓素腹腔注射可以誘導(dǎo)豚鼠內(nèi)耳膜迷路積水［10］，ADH可以使大鼠內(nèi)耳AQP2的表達增加，AQP7的表達減少［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，醋酸去氨加壓素在誘導(dǎo)豚鼠膜迷路積水的同時，也使豚鼠內(nèi)耳血管紋AQP2的表達增加。可能由于醋酸去氨加壓素是ADH的類似物，可以誘導(dǎo)內(nèi)耳AQP2的表達增加，而AQP2的增加使得內(nèi)淋巴的生成增多，造成了膜迷路積水。但AQP7的表達無明顯變化，分析可能原因如下：①醋酸去氨加壓素是ADH的類似物，其作用與ADH不完全等同；②大鼠和豚鼠可能存在種屬的差異；③本研究采用的是免疫組化的方法，雖然定位準(zhǔn)確，但不能精確定量。

AQP1是持續(xù)活化型水通道蛋白，不受ADH的調(diào)節(jié)。在AQP1的持續(xù)作用下，腎近曲小管的管腔面對水的通透性很大（Pf＞1 200μm／s）。大約20%的腎小球濾過的原尿不能在近曲小管吸收，但在加壓素的調(diào)節(jié)下，可以被集合管重新吸收。集合管主細胞至少有3種AQP，AQP2存在于主細胞管腔膜及其下的胞漿囊泡中，受ADH調(diào)節(jié)。AQP3和AQP4僅見于主細胞管周膜，為持續(xù)活化型［1］。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，集合管主細胞管腔面僅存在少量AQP2，細胞膜對水的通透性較低。在加壓素的刺激下，AQP2從管腔面下層的胞漿中通過穿梭機制到達管腔細胞膜表面，通過胞飲作用，將大量水?dāng)z入胞漿，再通過管周膜上的AQP3或AQP4，將水運送到細胞間質(zhì)，經(jīng)直小血管回到血循環(huán)。ADH水平下降時，ADH與受體分離，上述過程逆向進行，管腔面的AQP2減少，主細胞的細胞膜通透性下降，水分吸收減少。普遍認為，內(nèi)耳與腎臟有相似的解剖結(jié)構(gòu)，因而可能有類似的水、電解質(zhì)調(diào)節(jié)機制。本研究結(jié)果中，AQP1廣泛分布于內(nèi)耳，表達較穩(wěn)定，而AQP2則分布于內(nèi)耳的部分結(jié)構(gòu)中，如血管紋等，并在醋酸去氨加壓素作用下表達增加，這從一定程度上證實內(nèi)耳的水代謝與腎臟中的水代謝有類似之處。由此推論，醋酸去氨加壓素誘導(dǎo)的膜迷路積水，可能是由于AQP2表達的增加引發(fā)了一系列的反應(yīng)，使內(nèi)淋巴產(chǎn)生增多所致，其具體的發(fā)病機理仍需要進一步研究。

1 Lee MD，King LS，Ager P.The aquaporin family of water channel proteins in clinical medicine［J］.Medicine，1997，76：141.

2 Beitz E，Kμmagami H，Krippeit－Drews P，et al.Expression pattern of aquaporin water channels in the inner ear of the rat［J］.Hearing Research，1999，132：76.

3 Huang DL，Chen P，Chen SP，et al.Expression patterns of aquaporins in the inner ear：Evidence for concerted actions of multiple types of aquaporins to facilitate water transport in the cochlea［J］.Hearing Research，2002，165：85.

4 Takeda T，Takeda S，Kitano H，et al.Endolymphatic hydrops induced by chronic administration of vasopressin［J］.Hearing Research，2000，140：1.

5 黃德亮.小鼠內(nèi)耳水通道蛋白的定位和意義［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，2001，26：7.

6 Taguchi D，Takeda T，Kakigi A，et al.Expressions of aquaporin－2，vessopressin type－2 receptor，transient receptor potential channel vanilloid1（TRPV），TRPV4 in the human endolymphatic sac［J］.Laryngoscope，2007，117：695.

7 Lopez IA，Ishiyama G，Lee M，et al.Immunohistochemical localization of aquaporins in the human inner ear［J］.Cell Tissue Research，2007，328：453.

8 Takeda T，Taguchi D.Aquaporin as potential drug targets for Meniere’s disease and its releated disease［J］.Handb Exp Pharmacol，2009，190：171.

9 韓紅蕾，張連山，顧鳳明.正常豚鼠內(nèi)耳水通道蛋白的表達及意義［J］.臨床耳鼻咽喉科學(xué)雜志，2005，19：883.

10 韓紅蕾，張連山.醋酸去氨加壓素誘導(dǎo)豚鼠膜迷路積水［J］.中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志，2007，1：14.

11 Gu FM，Han HL，Zhang LS.Effect of vasopressin on gene expression in rat inner ear［J］.Hearing Research，2006，222：70.

（2009－08－03收稿）

（本文編輯 周濤）

Expression of Aquaporins in the Inner Ear of NormaIGuinea Pigs and Guinea Pigs with EndoIymphatic Hydrops

Han HongIei*，Zhang Lianshan，Gu Fengming（*Department of OtoIaryngoIogy of China－Japan Friendship HospitaI，Beijing，100029，China）

Objective To study the expression of aquaporins（AQPs）in the inner ear of normal guinea pig and guinea pigs with endolymphatic hydrops，and to investigate the mechanism and significance.Methods The guinea pigs were divided into two groups randomly：model group and control group.The guinea pigs in model group were given desmopressing 4μg·kg－1·d－1introperitoneally for 1 week，while the guinea pigs in control group were given saline.After one week，the expression of AQPs in the inner ears of all guinea pigs was evaluated.ResuIts Expression of AQP0，1，2，3，5，7 and 8 were found in the ears of normal guinea pigs.Weak expression of AQP0 was found in stria vascularis and spiral ganglion.The distribution of AQP1 consisted of cellular lining the bony labyrinth，fibrocytes lining in the endolymphatic duct and sac，cells under the basilar membrane，fibrocytes of the spiral ligament and the spiral limbus，Corti＇s organ，inner and outer spiral sulcus，stria vascularis，saccular and utricular wall，and spiral ganglion.AQP2 were found in stria vascularis，Corti＇s organ，spiral ganglion and endolymphatic sac.AQP3，7 and 8 were distributed in a similar manner as the surrounding membranous labyrinth，including Corti＇s organ，inner and outer spiral sulcus，stria vascularis，fibrocytes of the spiral ligament and the spiral limbus，saccular and utricular wall，endolymphatic sac and spiral ganglion.AQP5 was found at Corti＇s organ，inner and outer spiral sulcus，spiral ganglion and fibrocytes in spiral ligment.The AQP2 in stria vascularis and endolymphatic sac was stronger in the inner ears with ELH than that in normal ears.ConcIusion There are various AQPs in inner ears of normal guinea pigs，and their distributions are overlapping and without obvious regional specificity.Desmopressing induces the expression of AQP2 in the inner ears of guinea pigs.The results indicate that ELH maycorrelate toupregulation of AQP2，but the mechanism remains unclear.

Aquaporins； Endolymphatic hydrops； Desmopressin； Guineapigs

10.3969／j.issn.1006－7299.2010.04.015

R764.5

A

1006－7299（2010）04－0363－04

1 衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京 100029）； 2 北京協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科； 3 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉醫(yī)院

韓紅蕾，女，山東人，副主任醫(yī)師，研究方向：耳科學(xué)基礎(chǔ)與臨床。