夏茂盛，朱悅，高靜杰

（1.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001；2.遼河油田第二職工醫(yī)院 麻醉科，遼寧 盤錦 124010）

纖維黏連蛋白（fibronectin）是一種間盤細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，可以被基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP） 分解為纖維黏連蛋白碎片（fibronectin fragments，F(xiàn)n-f）［1］。在間盤退變過程中，F(xiàn)nf是一種退變的產(chǎn)物，其含量明顯增加。同時研究表明，F(xiàn)n-f又具有誘導(dǎo)間盤退變的作用［2］。將Fn-f注入髓核內(nèi)，間盤出現(xiàn)了退變樣改變；將Fn-f加入間盤細(xì)胞的培養(yǎng)液，間盤細(xì)胞基質(zhì)蛋白的合成明顯減少，而 MMP 的表達(dá)明顯增加［3，4］。然而目前 Fn-f誘導(dǎo)間盤退變的具體機(jī)制并不清楚。而纖維黏連蛋白和 Fn-f在細(xì)胞膜上主要的受體是整合素 α5β1［5，6］。因此，本實(shí)驗(yàn)將Fn-f加入髓核細(xì)胞的培養(yǎng)液，觀察Fn-f對其受體整合素α5和β1亞基表達(dá)的影響，探討Fn-f誘導(dǎo)間盤退變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物為日本大耳白兔，3月齡，10只，體質(zhì)量（2 500±200）g；試劑為纖維黏連蛋白碎片（110 kDa，Sigma）、用于免疫沉淀的整合素α5和β1亞基抗體和蛋白G瓊脂糖小球（upstate biotechnology）、用于Western blot和免疫熒光的鼠抗整合素 α5、β1、II型膠原蛋白、MMP9和MMP13的單克隆抗體（SantaCruz）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：無菌取出兔間盤髓核組織，0.2%的膠原酶消化4 h，用D-Hanks進(jìn)行酶液清洗3次。然后用培養(yǎng)液DMEM/F12+15%胎牛血清重懸細(xì)胞，以2×104/cm2接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。約6～7 d后，待細(xì)胞貼壁完全第1次換液，以后隔2～3 d換液，細(xì)胞生長到80%融合后，用0.25%胰酶消化傳代。第3代細(xì)胞長到70%～80%融合后，將培養(yǎng)液去除，實(shí)驗(yàn)組加入含有Fn-f的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，F(xiàn)n-f的濃度為100nmol/L，對照組則只加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)2 d。

1.2.2 Western免疫印跡：培養(yǎng)2 d后，去除培養(yǎng)液，加入裂解液，收集細(xì)胞裂解液，用Bradford法測各個樣品蛋白含量。比較兩組間整合素α5和β1含量，取實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品各1 000μg加入8μg抗-整合素亞型（α5或 β1）的抗體，4 °C 孵育 12 h。然后向樣品中加入200μl蛋白G瓊脂糖小球，4°C孵育2 h。離心（14 000 g，5 s）收集瓊脂糖小球，并在沸水中煮5 min。取上清加入準(zhǔn)備好的10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離樣品。而比較II型膠原蛋白、MMP9、MMP13在兩組間含量時，樣品蛋白含量定量后，每組樣品取的蛋白量一致，均為50μg，直接將樣品加入準(zhǔn)備好的10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離樣品。以后實(shí)驗(yàn)步驟相同，電泳分離樣品后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。封閉后，在膜上分別加入鼠整合素亞型 （α5、β1）、II型膠原蛋白、MMP9 和MMP13的特異性一抗，1∶1 000稀釋，孵育2 h。洗膜1 h后，加入羊抗鼠的二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記，1∶2 000稀釋，孵育2 h。最后纖維素膜用ECL底物顯影到膠片上，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果用圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 免疫熒光：細(xì)胞培養(yǎng)2 d以后，將培養(yǎng)液倒出，用PBS稍洗細(xì)胞，然后在-20°C條件下用純甲醇固定6 min。固定后的細(xì)胞經(jīng)PBS稍洗細(xì)胞后，封閉30 min，然后加入一抗，鼠抗兔的針對整合素α5亞基和Ⅱ型膠原蛋白的一抗同時加入，針對整合素β1亞基和Ⅱ型膠原蛋白的一抗同時加入，4°C過夜。洗去一抗后，加入TRITC和FITC結(jié)合的二抗，室溫2 h。然后PBS洗細(xì)胞30 min，甘油封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：將細(xì)胞裂解后，應(yīng)用Trizol等提取總核糖核酸（RNA）。用TAKARA試劑盒，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1。反應(yīng)條件是94℃2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 35 個循環(huán)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)紫外分光儀比較PCR產(chǎn)物的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，多樣本采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 用于RT-PCR的引物序列Tab.1 The sequences of the primers used for RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)的變化

加入Fn-f后髓核細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì)胞體積縮小，有多角形轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長形，并可見少量細(xì)胞碎裂，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間顆粒樣物質(zhì)明顯增多（圖1）。

2.2 蛋白表達(dá)的變化

經(jīng)Fn-f作用后，整合素 α5、β1亞基和MMP9、MMP13的含量都明顯增加，與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而Ⅱ型膠原蛋白的含量明顯下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。免疫熒光技術(shù)觀察到整合素α5、β1均表達(dá)在細(xì)胞膜上，經(jīng)Fn-f作用后，這兩種蛋白在胞膜上的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而Ⅱ型膠原蛋白的熒光強(qiáng)度明顯降低（圖 2）。

2.3 基因表達(dá)的變化

經(jīng) Fn-f作用后，整合素 α5、β1亞基、MMP9、MMP13的表達(dá)均明顯升高，而Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)明顯降低（圖3）。

3 討論

表2 兩組整合素α5、β1亞基、MMP9、MMP13和II型膠原蛋白含量的比較Tab.2 The comparison of integrinα5,β1 subunits,MMP9,MMP13 and collegen IIprotein content

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n-f可以誘導(dǎo)間盤髓核細(xì)胞退變。在加入Fn-f后，髓核細(xì)胞的Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)降低，而MMP9和MMP13的表達(dá)明顯升高。在Fn-f的干預(yù)下，整合素α5β1的表達(dá)增加，這說明Fn-f有促進(jìn)其受體表達(dá)增加的作用。

Fn-f是間盤退變過程中纖維黏連蛋白的分解產(chǎn)物，在退變間盤內(nèi)的含量明顯增加［8］。究其原因有兩方面，一方面是纖維黏連蛋白在退變間盤內(nèi)的表達(dá)增多［9，10］，另一方面在退變過程中MMP的表達(dá)明顯增加，而正是MMP將纖維黏連蛋白分解為Fn-f［11］。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都證明了Fn-f有減少糖蛋白表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)蛋白分解的作用［2～4］。本實(shí)驗(yàn)同樣證明了這個結(jié)論，F(xiàn)n-f減少了II型膠原蛋白的表達(dá)，增加了MMP9和MMP13的表達(dá)。但Fn-f誘導(dǎo)間盤退變的具體機(jī)制并不清楚。而Fn-f同樣有誘導(dǎo)軟骨退變的作用，發(fā)現(xiàn)Fn-f在軟骨細(xì)胞膜上的受體是整合素 α5β1［12，13］，并且 Fn-f有增加整合素 α5和 β1亞基表達(dá)的作用［14］。整合素α5和β1亞基在間盤內(nèi)同樣有表達(dá)［7］，而且整合素α5β1是纖維黏連蛋白和Fn-f在間盤細(xì)胞膜上主要的受體［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了在Fn-f作用下的髓核細(xì)胞整合素α5和β1亞基的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)α5和β1亞基表達(dá)明顯增加。

研究Fn-f的退變機(jī)制時，Homandberg提出Fn-f的作用由Fn-f、MMP、纖維黏連蛋白、II型膠原蛋白組成的正反饋惡性循環(huán)，即Fn-f增加了MMP的表達(dá)，增加的MMP分解纖維黏連蛋白形成更多的Fnf，而II型膠原蛋白的表達(dá)減少是這個惡性循環(huán)的最終結(jié)局［15］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這個理論一致。本研究同樣發(fā)現(xiàn)Fn-f有促進(jìn)整合素α5、β1亞基表達(dá)作用。由于整合素α5β1在Fn-f誘導(dǎo)間盤退變過程中起到了膜受體的作用，而Fn-f又有促進(jìn)其受體表達(dá)增加的作用，那么可以將整合素α5β1納入這個正反饋惡性循環(huán)，即Fn-f與髓核細(xì)胞膜上的整合素α5β1結(jié)合后，影響了髓核細(xì)胞的代謝，MMP和受體整合素α5β1的表達(dá)都增加，MMP分解纖維黏連蛋白使Fn-f的量增加，而整合素α5β1表達(dá)的增加使Fn-f的結(jié)合位點(diǎn)增多，促進(jìn)了Fn-f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的作用。因此，整合素α5β1既是Fn-f在間盤細(xì)胞上的受體，同時又是Fn-f誘導(dǎo)間盤退變的正反饋惡性循環(huán)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)測定了Fn-f對于間盤髓核細(xì)胞的影響，初步探討了Fn-f對于間盤整合素α5β1表達(dá)的影響。但由于本實(shí)驗(yàn)只是體外培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行的研究，體內(nèi)環(huán)境下Fn-f誘導(dǎo)間盤退變的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

［1］Omlor GW，Lorenz H，Engelleiter K，et al.Changes in gene expression and protein distribution at different stages of mechanically induced disc degeneration——an in vivo study on the New Zealand whiterabbit［J］.JOrthop Res，2006，24（3）：385-392.

［2］Aota Y，An HS，Homandberg G，etal.Differential effectsof fibronectin fragment on proteoglycan metabolism by intervertebral disc cells：a comparison with articular chondrocytes［J］.Spine，2005，30（7）：722-728.

［3］Greg Anderson D，Li X，Tannoury T，et al.A fibronectin fragment stimulates intervertebral disc degeneration in vivo［J］.Spine，2003，28（20）：2338-2345.

［4］Anderson DG，Li X，Balian G.A fibronectin fragment alters the metabolismbyrabbitintervertebraldisccellsinvitro［J］.Spine，2005，30（11）：1242-1246.

［5］Gilchrist CL，Chen J，Richardson WJ，et al.Functional integrin subunitsregulatingcell-matrix interactionsin theintervertebral disc［J］.JOrthop Res，2007，25（6）：829-840.

［6］Homandberg GA，Costa V，Ummadi V，etal.Antisenseoligonucleotides totheintegrin receptor subunit alpha（5）decreasefibronectin fragmentmediatedcartilagechondrolysis［J］.OsteoarthritisCartilage，2002，10（5）：381-393.

［7］Nettles DL，Richardson WJ，Setton LA.Integrin expression in cells of theintervertebral disc［J］.JAnat，2004，204（6）：515-520.

［8］Oegema TRJr，Johnson SL，Aguiar DJ，et al.Fibronectin and its fragments increase with degeneration in the human intervertebral disc［J］.Spine，2000，25（21）：2742-2747.

［9］Omlor GW，Lorenz H，Engelleiter K，et al.Changes in gene expression and protein distribution at different stages of mechanically induced disc degeneration--an in vivo study on the New Zealand white rabbit［J］.JOrthop Res，2006，24（3）：385-392.

［10］Nerlich AG，Bachmeier BE，Boos N.Expression of fibronectin and TGF-beta1 mRNA and protein suggest altered regulation of extracellularmatrixindegenerateddisctissue［J］.Eur SpineJ，2005，14（1）：17-26.

［11］Hsu CC，Lai SC.Matrix metalloproteinase-2，-9 and-13 are involved in fibronectin degradation of rat lung granulomatous fibrosis caused by angiostrongyluscantonensis［J］.Int JExp Pathol，2007，88（6）：437-443.

［12］Homandberg GA，Costa V，Wen C.Fibronectin fragments active in chondrocytic chondrolysis can be chemically cross-linked to the alpha5 integrin receptor subunit［J］.Osteoarthritis Cartilage，2002，10（12）：938-949.

［13］Forsyth CB，Pulai J，Loeser RF.Fibronectin fragments and blocking antibodies to alpha2 beta1 and alpha5beta1 integrins stimulate mitogen-activated protein kinase signaling and increase collagenase 3（matrix metalloproteinase 13）production by human articular chondrocytes［J］.Arthritis Rheum，2002，46（9）：2368-2376.

［14］Takahashi I，Onodera K，Sasano Y，et al.Effect of stretchingon gene expression of beta1 integrin and focal adhesion kinase and on chondrogenesisthroughcell-extracellularmatrixinteractions［J］.Eur JCell Biol，2003，82（4）：182-192.

［15］Homandberg GA.Potential regulation of cartilagemetabolismin osteoarthritisbyfibronectinfragments［J］.Front Biosci，1999，4：D713-730.