馬俊偉，常楚，戰(zhàn)杰，梁曉旭

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬一院骨科，沈陽(yáng) 110001；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 奉天醫(yī)院手外科，沈陽(yáng) 110024）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其具有低免疫原性、多向分化及高增殖潛能而倍受關(guān)注。MSCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞同來(lái)源于中胚層，理論上具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的可能。我們采用健康Wistar大鼠的MSCs，研究其體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力和相應(yīng)誘導(dǎo)條件，為組織工程的應(yīng)用創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子165（vascular endothelial growth factor 165，VEGF165），美國(guó) PeproTech 公司；L-DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶，美國(guó)Gibco公司；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor-1，VEGFR-1/Flt-1）抗體、濃縮型免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；YJ-875型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 MSCs分離培養(yǎng)

將Wistar大鼠（體質(zhì)量100 g左右，雌雄不限，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）處死后，無(wú)菌條件下取出大鼠股骨和脛骨，用PBS沖出骨髓，充分混勻后按1∶2比例緩慢加在比重為1.073 g/L的percoll分離液上，2 000 r/min離心30 min，吸取液面交界處的單個(gè)核細(xì)胞，L-DMEM培養(yǎng)液洗滌2次。將上述細(xì)胞以1×106/cm2密度接種于含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基（含100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素）的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，24 h后吸出未貼壁細(xì)胞懸液重新培養(yǎng)，排除成熟內(nèi)皮細(xì)胞的干擾，以后每3 d換液1次，除去非貼壁細(xì)胞。每日在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄原代細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞80%以上融合后用0.25%胰蛋白酶消化按1∶2比例傳代，傳至第3代的MSCs作為種子細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件

根據(jù)培養(yǎng)液將其分組，A組：為基礎(chǔ)液，含有10%胎牛血清 L-DMEM、維生素 C（50 μg/ml）、青-鏈霉素（100 U/ml）；B 組：A 組基礎(chǔ)液+5 ng/ml VEGF165；C組：A組基礎(chǔ)液+10 ng/ml VEGF165；D組：A組基礎(chǔ)液+50 ng/ml VEGF165；E 組：A 組基礎(chǔ)液+100 ng/ml VEGF165。將傳至第3代細(xì)胞分別接種于相應(yīng)的培養(yǎng)板中，加入相應(yīng)的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)觀察。

1.4 MTT法檢測(cè)VEGF165對(duì)MSCs增殖的影響

將細(xì)胞按每孔200μl接種于96孔培養(yǎng)板中，每組3孔，移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，每孔中加MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，輕輕吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測(cè)量吸光度（A）值。

1.5 細(xì)胞誘導(dǎo)分化

用0.25%胰蛋白酶消化生長(zhǎng)狀態(tài)良好的體外培養(yǎng)的第3代大鼠MSCs，終止消化，離心，棄上清，用含有10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液再懸細(xì)胞，并稀釋形成密度為1×106/ml的液體，加入事先配好的各組培養(yǎng)液混勻后接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)14 d。每3 d換液1次，每日鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 VEGFR-1/Flt-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色

分別收集各組培養(yǎng)14 d后的細(xì)胞，PBS洗2~3次，每次5 min，無(wú)水甲醇固定20 min，滴加3%H2O2，室溫靜置30 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，滴加一抗，室溫靜置1 h，滴加二抗40~50μl，37℃ 2 h，PBS洗 4次，每次 5 min，DAB 顯色5~10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，蘇木素復(fù)染、封片，鏡檢，記錄VEGFR-1/Flt-1染色細(xì)胞陽(yáng)性率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs體外培養(yǎng)

第1~3代MSCs增長(zhǎng)迅速，傳代細(xì)胞1~3 d為潛伏期，隨即快速增殖并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5~6 d達(dá)高峰期，此后進(jìn)入平臺(tái)期。細(xì)胞接種后的最初幾日，培養(yǎng)板中可見(jiàn)較多的懸浮細(xì)胞，主要為造血系細(xì)胞，隨著不斷的細(xì)胞換液而被清除，接種細(xì)胞于2 d左右逐漸貼壁，貼壁細(xì)胞以較為均勻的小梭形細(xì)胞為主；7 d后細(xì)胞迅速增殖；10 d左右可見(jiàn)典型的克隆集落，中心細(xì)胞為近圓形，密集生長(zhǎng)，外周細(xì)胞為長(zhǎng)梭形纖維樣細(xì)胞，呈魚群狀排列。見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)

經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，B、C、D、E組的細(xì)胞形態(tài)與A組比較無(wú)顯著差異。B~E組細(xì)胞增殖迅速，從第7天開始融合，至誘導(dǎo)后14 d達(dá)到相互融合（圖2）。

2.3 VEGF165對(duì)MSCs增殖的影響

培養(yǎng) 24 h 后，A、B、C、D、E 組吸光度值平均分別為 0.358 0±0.033 2、0.580 6±0.073 9、0.627 8±0.079 6、0.175 8±0.053 7 和 0.202 4±0.012 5，B 組、C組與A組比較，B組與C組比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B、C組具有明顯的促進(jìn)增值作用，且C組促增殖作用明顯強(qiáng)于B組；D組、E組與A組比較，差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），D、E組的促增殖作用不如A組。

2.3 VEGFR1/Flt1免疫組化染色結(jié)果及細(xì)胞陽(yáng)性率

MSCs經(jīng)過(guò) 14d 的培養(yǎng)，A、B、C、D、E 組 VEGFR-1/Flt-1免疫組化染色細(xì)胞陽(yáng)性率分別為（2.159 8±0.255 5）%、（30.3591±5.1687）%、（44.7643±2.1011）%、（56.0111±2.9603）%、（86.2438±0.9663）%。其中任意 2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨著濃度的增高，被染為棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞比例逐漸增高。見(jiàn)圖3。

3 討論

MSCs是源于骨髓基質(zhì)的一類間充質(zhì)干細(xì)胞，在過(guò)去的十年間受到了廣泛的關(guān)注和深入的研究。它們以前被認(rèn)為在紅細(xì)胞生成過(guò)程中起關(guān)鍵作用［1］，但是近年來(lái)其自我增殖和多項(xiàng)分化潛能逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)MSCs的組織工程學(xué)應(yīng)用研究較多，多將MSCs誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪等組織細(xì)胞。

目前實(shí)驗(yàn)中所使用的促骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的因子有很多，Norrby［2］描述了38種之多，然而在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的仍然是VEGF和bFGF。VEGF是在1970年被Dvorak及其助手發(fā)現(xiàn)的，以其再生血管活力而周知，但血管化和血管發(fā)生的分子機(jī)制尚不完全清楚，甚至是有爭(zhēng)議的［3，4］。盡管如此，最近仍然有不同的學(xué)者采用不同的方法誘導(dǎo)MSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化獲得成功，但是其中大多是采用了包含VEGF在內(nèi)的多種因子聯(lián)合誘導(dǎo)的雞尾酒式的方法［5］，但是對(duì)于單純使用VEGF誘導(dǎo)的報(bào)道相對(duì)較少，并且對(duì)于如何才能提高誘導(dǎo)率未提及［6］。本研究不僅單獨(dú)應(yīng)用VEGF165誘導(dǎo)MSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化獲得成功，并且根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)不同的VEGF165濃度設(shè)置了分組實(shí)驗(yàn)并證明其誘導(dǎo)效果并不相同。此外，本研究還證明VEGF在促進(jìn)MSCs的作用，我們發(fā)現(xiàn)保持高濃度的VEGF165（50 ng/ml）并不能夠提高M(jìn)SCs的增殖，其促進(jìn)增殖作用反而不如低濃度組，而保持相對(duì)的高濃度對(duì)于促進(jìn)誘導(dǎo)分化具有良好作用。對(duì)于誘導(dǎo)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè)，現(xiàn)在的試驗(yàn)大多檢測(cè) CD34、CD31、vWF、Flk-1 等血管內(nèi)皮細(xì)胞特有表面標(biāo)志，本研究選用了Flt-1作為檢測(cè)指標(biāo)，F(xiàn)lt-1不但與Flk-1/KDR共同調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的分裂，而且通過(guò)影響Flk-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控毛細(xì)血管的出芽生長(zhǎng)，在血管新生中起主要作用［7］。Flt-1在MSCs表面不表達(dá)，誘導(dǎo)分化2周以后，我們發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)各組Flt-1均有不同程度的表達(dá)，且VEGF165濃度在50和100 ng/ml時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)能力，其Flt-1表達(dá)更加強(qiáng)烈。

盡管MSCs具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，但目前研究?jī)H處于起步階段，有待于繼續(xù)攻克一些難題，例如：（1）如何找到最具價(jià)值的MSCs的特異性表面標(biāo)記，對(duì)其分離純化；（2）MSCs多向分化的生物學(xué)機(jī)制及其中是否存在發(fā)生可以向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化分化的亞群；（3）MSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的最佳條件是什么，如何提高誘導(dǎo)率。

我們相信，隨著對(duì)上述問(wèn)題的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和解決，以MSCs細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞、基因和組織工程治療手段在臨床有關(guān)復(fù)雜器官組織工程血管化及細(xì)胞移植修復(fù)損傷組織等方面具有巨大的發(fā)展前景。

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