賈慧敏，王曉東，陳青江，張濤，王維林

（1.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院小兒外科，衛(wèi)生部小兒先天畸形重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110004；2.沈陽市第四人民醫(yī)院普外科，沈陽110031）

肛門直腸畸形（anorectal malformations，ARM）術(shù)后排便功能障礙與神經(jīng)肌肉的異常發(fā)育導(dǎo)致腸道動力改變密切相關(guān)，然而ARM神經(jīng)肌肉發(fā)育異常的機(jī)制至今仍不清楚，與ARM的胚胎發(fā)生機(jī)制是否相通也不明了［1］。目前認(rèn)為Notch信號通路在調(diào)控細(xì)胞生長分化、組織更新及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用［2，3］。Notch信號通路尤其在胃腸道的胚胎發(fā)育過程中起著重要作用［4］。Notch-1及其配體Jagged-2是表達(dá)于腸道基質(zhì)的兩種重要的Notch通路中的成員，但迄今為止其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制仍不清楚，是否參與ARM發(fā)生后末端直腸的發(fā)育也無報(bào)道。本研究通過對Notch-1及Jagged-2基因在E16~E21的正常及ARM大鼠胚胎直腸的表達(dá)情況來探討它們可能在ARM大鼠胚胎的直腸發(fā)育中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用體質(zhì)量為220～250 g健康成熟未育的Wistar大鼠75只，雌鼠60只，雄鼠15只（購自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與取材：按雌雄比例4∶1晚上合籠過夜，次日晨雌鼠做陰道涂片。在光鏡下見到精子即提示交配，當(dāng)日為孕0 d（E0），并隨機(jī)分為2組。ETU組：40只孕鼠于E10時(shí)按125 mg/kg給予1%乙烯硫脲（ethylenethiourea，ETU）經(jīng)胃管注入大鼠胃內(nèi)；對照組：20只灌入等量蒸餾水，繼續(xù)保持妊娠。ETU組和對照組大鼠分別做以下處理：于E16~E21根據(jù)計(jì)劃選取一定數(shù)量各胎齡的孕鼠，在10%水合氯醛（4 m1/kg）腹腔注射麻醉下，應(yīng)用解剖顯微鏡（放大倍數(shù)7.5～64倍）行剖宮術(shù)，取出所有胎鼠，其中E16胚胎取整個(gè)胚胎，E17~E21胚胎取其盆部，所有標(biāo)本經(jīng)0.01 mol/LPBS液沖洗。部分E17、E19、E21的對照組和ETU組的胎鼠，在顯微鏡下辨別畸形后進(jìn)一步分為正常組和ARM組，無菌條件下取直腸末端/盲端部分置于EP管中于-80℃深凍保存，備Western blot及RT-PCR用。其余標(biāo)本置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定12~36 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成蠟塊。

1.2.2 免疫組化方法：對照組及ETU組的胎鼠正中矢狀面及橫斷面連續(xù)切片，根據(jù)鏡下觀察進(jìn)一步分為正常組和ARM組，進(jìn)行Notch-1及Jagged-2一抗（1∶150）免疫組化染色。連續(xù)動態(tài)對比觀察Notch-1及Jagged-2在正常和畸形大鼠胚胎結(jié)直腸發(fā)育過程中的表達(dá)。免疫組化染色具體步驟：加入一抗，4℃孵育12 h。二抗采用S-P試劑盒，DAB顯色經(jīng)蘇木素復(fù)染，脫水、透明后封片。Notch-1及Jagged-2免疫組織化學(xué)染色見胞漿呈棕黃色為陽性，該細(xì)胞為陽性細(xì)胞。每次染色均設(shè)陰性和陽性對照。采用NISElements Basic Research多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)對Notch-1及Jagged-2的表達(dá)進(jìn)行圖像分析。

1.2.3 Western blot方法：（1）顯微鏡下取新鮮末端直腸組織應(yīng)用南京凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。其含量按改良Lowry法測定，于-20℃凍存?zhèn)錅y。（2）Western雜交：取總蛋白 40μl，經(jīng)6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜（Invitrogen公司）上，5%牛血清白蛋白封閉抗原后，加入Notch-1及Jagged-2抗體（1∶200）和 β-actin抗體（1∶5 000），4℃孵育 12 h。次日洗膜后加堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）進(jìn)行二抗雜交、顯色。結(jié)果采用GIS-2020凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果，對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行密度分析，以相對灰度值代表蛋白表達(dá)量。

1.2.4 RT-PCR檢測組織中Notch-1、Jagged-2 mRNA的表達(dá)：（1）總 RNA 提??；（2）逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司，采用試劑盒推薦方法。（3）Notch-1、Jagged-2基因的 PCR擴(kuò)增：引物設(shè)計(jì)參考美國國立醫(yī)學(xué)圖書館Medline基因庫，利用Primer 5.0版軟件設(shè)計(jì)引物，由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，各基因引物序列及擴(kuò)增條件見表1。（4）瓊脂糖凝膠電泳。用G：BOX SYNGENE凝膠分析系統(tǒng)拍照，以Kodar Digital Science 1.0 DNA分析軟件系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。以βactin內(nèi)參照相對密度mass（ng）值標(biāo)化Notch-1、Jagged-2 mRNA的mass值，得到相對含量進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，差異比較采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對照組共產(chǎn)胎仔192只，未見畸形。ETU組中221只出現(xiàn)ARM，畸形率為61.1%；均為直腸尿道瘺和泄殖腔畸形。根據(jù)切片觀察及顯微鏡下觀察后分為正常組（n=120）和ARM組（n=150）進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。

2.2 Notch-1及Jagged-2大鼠胚胎期直腸壁內(nèi)的表達(dá)情況

表1 Notch-1、Jagged-2及β-actin引物序列及擴(kuò)增片段長度Tab.1 Primer sequences and product size of Notch-1，Jagged-2 andβ-actin amplification

2.2.1 免疫組化染色結(jié)果：正常組：E16時(shí)，腸壁各層發(fā)育尚不清晰，并未觀察到明顯的陽性細(xì)胞；E17時(shí)，直腸壁環(huán)肌層逐漸發(fā)育，并可見陽性細(xì)胞群位于肌肉細(xì)胞內(nèi)，黏膜層也有表達(dá)；E19-20，腸壁肌層發(fā)育逐漸完善，縱肌層開始分化，并可見大量陽性細(xì)胞位于腸道平滑肌及腸間神經(jīng)叢部位（myenteric nerve plexus，MP）和黏膜層。ARM組：E16時(shí)，可以觀察到所有標(biāo)本短尾或無尾，直腸尿道間存在瘺管；直至E17時(shí)，直腸盲端及瘺管周圍均并未見到陽性細(xì)胞表達(dá)；E19后，上位結(jié)腸可見大量陽性細(xì)胞位于腸壁內(nèi)；隨著接近盲端，腸壁各層分化不良，盲端已經(jīng)見不到正常腸壁結(jié)構(gòu)，陽性細(xì)胞分布逐漸減少，橫斷面上更顯示出瘺管周圍肌肉形態(tài)異常，也不能看到神經(jīng)叢結(jié)構(gòu)；E20~21，這種變化更加明顯（圖1、2）。

Jagged-2在大鼠胚胎期直腸壁內(nèi)的表達(dá)情況：免疫組化結(jié)果提示Jagged-2的表達(dá)時(shí)空分布與Notch-1相同（圖略）。

2.2.2 Western blot結(jié)果：在17 d以后，Notch-1在正常組和ARM組都有表達(dá)，E17~21時(shí)正常組的表達(dá)較致畸組明顯增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3，表2）。

2.2.3 RT-PCR結(jié)果：在17 d以后，Notch-1在正常組和ARM組都有表達(dá)，E17~21時(shí)正常組的表達(dá)較致畸組強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4，表2）。

3 討論

肛門直腸畸形術(shù)后排便功能障礙與末端直腸的神經(jīng)肌肉的異常發(fā)育導(dǎo)致腸道動力改變密切相關(guān)，而腸管的神經(jīng)肌肉的形成過程非常復(fù)雜，受多種因素調(diào)控。

目前研究認(rèn)為Notch信號通路對于胃腸道的胚胎形成、腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞（gut neural crest stemcells，GNCSC）的遷移增殖、分化及腸壁平滑肌的發(fā)育都有影響［5，6］。并在多種細(xì)胞的分化過程中起關(guān)鍵作用的通路［7］。Notch是一種進(jìn)化保守的跨膜蛋白受體，Notch胞外區(qū)與相鄰細(xì)胞表面的配體結(jié)合后被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號的胞內(nèi)域NICD（intracelluar domain of Notch），NICD 進(jìn)入細(xì)胞核后借助于RAM域和ankyrin重復(fù)序列與RBP-JK/CBF-1和Mastermind相互作用形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，調(diào)控Hes和Hey家族基因等基因的表達(dá)［8］。Notch信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對于維持神經(jīng)干細(xì)胞的活性發(fā)揮至關(guān)重要的作用［9］，還能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元的發(fā)育［10］，心臟內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的分化［11］。在脊椎動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種Notch受體分子（Notch 1-4） 及五種配體（Jagged 1，2；Delta 1，3，4）。Sander GR.等人發(fā)現(xiàn)存在于腸神經(jīng)系統(tǒng)的兩種Notch信號通路分子，即Notch-1及Jagged-2均表達(dá)于MP的神經(jīng)節(jié)處［12］。

表2 各組別Notch-1 mRNA及Notch-1蛋白定量對比結(jié)果（x±s）Tab.2 The expression of Notch-1 mRNA and protein in normal and ARM groups（x ±s）

基于Notch-1及Jagged-2在腸管發(fā)育中的角色，我們利用ETU致畸的ARM動物模型觀察Notch-1及Jagged-2在畸形發(fā)生后末端直腸的表達(dá)，以期得到一些有益的啟示。

本研究結(jié)果證明，在直腸胚胎發(fā)育中，Notch-1/Jagged-2在腸壁肌肉及神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)，與兩者的發(fā)育過程同步，隨著腸道發(fā)育的成熟，Notch-1/Jagged-2的表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Notch-1/Jagged-2信號分子在腸管的發(fā)育過程中，主要位于腸管的MP和腸壁平滑肌的環(huán)肌層，推測其可能對腸管神經(jīng)肌肉發(fā)育起一定的的調(diào)控作用。

在ARM組，結(jié)果表明胚胎E16時(shí)，未見到陽性表達(dá)的細(xì)胞；E17后直腸壁內(nèi)出現(xiàn)陽性細(xì)胞，上位結(jié)腸可見大量陽性細(xì)胞位于腸壁內(nèi)；隨著接近盲端，腸壁各層分化不良，陽性細(xì)胞分布逐漸減少，橫斷面上更顯示出瘺管周圍肌肉形態(tài)異常，也不能看到神經(jīng)叢結(jié)構(gòu)；E20~21，這種變化更加明顯，Western Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與組化結(jié)果一致。RT-PCR的結(jié)果證實(shí)了上述基因mRNA水平的改變，與正常組相比，Notch-1及Jagged-2的表達(dá)明顯降低。根據(jù)Notch-1及Jagged-2基因在ARM動物模型直腸壁表達(dá)水平的差異，推測它們可能與ARM末端直腸神經(jīng)肌肉發(fā)育不良存在相關(guān)性。

Notch信號通路的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，如果揭示上述發(fā)育基因的確切調(diào)控機(jī)制仍然需要大量的深入實(shí)驗(yàn)。這也正是我們課題組下一步的研究方向，目前正在進(jìn)行中。

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