于曉巖，孫艷麗，胡瑜，富建華

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院兒科，沈陽(yáng)110004）

慢性肺疾?。╟hronic lung disease，CLD）是患有心肺疾病的新生兒，特別是早產(chǎn)兒，由于長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧或高容量、高壓力的機(jī)械通氣等治療因素共同作用于未成熟肺，而導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥。其特征性病理變化為：早期肺泡炎性反應(yīng)和晚期不可逆的肺間質(zhì)纖維化。到目前為止，關(guān)于CLD確切發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論，因此也缺乏有效的防治手段，故探索CLD肺纖維化的發(fā)生機(jī)制成為當(dāng)今新生兒領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題?，F(xiàn)研究認(rèn)為，肺成纖維細(xì)胞異常增殖，造成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成及降解失衡是高氧致CLD肺纖維化發(fā)生的根源，而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的最終環(huán)節(jié)又發(fā)生在細(xì)胞周期水平上。因此，本實(shí)驗(yàn)采用高氧誘導(dǎo)新生大鼠肺纖維化模型，研究細(xì)胞周期依賴蛋白激酶2（cyclin-dependent kinase-2，CDK2）及細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitors，P27）的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化及其對(duì)CLD肺纖維化的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選用足月新生Wistar大鼠64只（由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供）。主要試劑：兔抗大鼠CDK2單克隆抗體、小鼠抗大鼠P27單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司；RNAisoTMPlus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBRRPremix Ex TaqTM均購(gòu)自 Takara 大連寶生物技術(shù)有限公司；引物由Takara大連寶生物技術(shù)有限公司合成。主要儀器：氧箱，測(cè)氧儀（美國(guó)生產(chǎn)型號(hào)為OM-ME），Dapex氣體分析儀，美國(guó)Universal Imagining Porppration圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備：將新生大鼠依據(jù)吸入氧濃度隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組32只，雌雄不限。實(shí)驗(yàn)組生后即置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持氧濃度為0.90（用測(cè)氧儀檢測(cè)），CO2濃度＜0.5%（用鈉石灰吸收，Dapex氣體分析儀檢測(cè)），溫度為25~27℃，濕度50%~70%（用變色硅膠吸收水蒸汽）。每天定時(shí)開(kāi)箱0.5 h，添加水、飼料及更換墊料，并與對(duì)照組交換代母鼠，以避免因氧中毒而致喂養(yǎng)能力下降。對(duì)照組置于空氣中，具體方法及控制因素同實(shí)驗(yàn)組［1］。

1.2.2 標(biāo)本的收集：于實(shí)驗(yàn)后3、7、14、21 d分別從兩組中隨機(jī)抽取8只，用10%的水合氯醛麻醉后立即打開(kāi)胸腔，分離肺組織。將左肺置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，常規(guī)制備5μm切片用于HE染色，右肺置于-80℃冰箱凍存，用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)和Western blot分析。

1.2.3 肺組織纖維化評(píng)分：按Ashcroft等人的方法于10倍光鏡下進(jìn)行雙盲纖維化評(píng)分［2］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為正常肺組織；1分為肺泡或細(xì)支氣管壁少許纖維化，2~3分為中度纖維化而肺泡結(jié)構(gòu)無(wú)改變；4~5分為有明確的肺泡結(jié)構(gòu)改變（肺泡壁明顯增厚），纖維束或纖維小結(jié)形成；6~7分為有嚴(yán)重肺泡結(jié)構(gòu)改變和大片纖維化；8分為完全纖維化。

1.2.4 肺組織CDK2及P27蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用SP免疫組織化學(xué)方法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用抗原熱修復(fù)法，正常山羊血清封閉，兔抗大鼠CDK2單克隆抗體及小鼠抗大鼠P27單克隆抗體（1∶200）4℃過(guò)夜，生物素標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG抗體37℃30 min，鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶37℃10 min，DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染，水化30 min，常規(guī)脫水，樹(shù)膠封片。結(jié)果判定：應(yīng)用美國(guó)Universal Imaging Porpomtion圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用Meta Morph軟件分析圖像平均灰度值，并用來(lái)表示CDK2及P27表達(dá)的強(qiáng)度，平均灰度值與蛋白表達(dá)水平呈反比。

1.2.5 肺組織CDK2及P27基因表達(dá)檢測(cè)：實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)用TRIzol一步法提取肺組織RNA。采用SYBRGreenⅠ熒光染料嵌合法檢測(cè)CDK2 mRNA及P27 mRNA。先構(gòu)建目的基因（CDK2基因和P27基因）和管家基因（GAPDH）的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量。通過(guò)管家基因的校正，檢測(cè)各組肺組織中CDK2及P27目的基因的相對(duì)表達(dá)量。CDK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量=CDK2基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。P27 mRNA的相對(duì)表達(dá)量=P27基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。校正結(jié)果以生理鹽水對(duì)照組為1，其余組與之相比較。PCR反應(yīng)體系的組成參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37℃ 15 min，85℃ 5 s，PCR 擴(kuò)增 95℃ 10 s，1 個(gè)循環(huán)，55 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)。CDK2、P27 和GAPDH 引物序列如下：CDK2-F 5′-CATCAAGCTGGCTGACTTTGGA-3；CDK2-R 5′-GTGGAGTAGTACT TGCGCCC AGAA-3′；P27-F 5’-TTGGTGGAC －CAAATGCCTGA-3’；P27-R5’-GCTCCACAGTGCCAGCA TTC-3’；GAPDH-F 5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′；GAPDH-R 5′-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3′。CDK2產(chǎn)物片段 126 bp，P27產(chǎn)物片段 169 bp，GAPDH產(chǎn)物片段144 bp。

1.2.6 Western blot分析：取大約100 mg肺組織置于0.5 ml蛋白裂解液中，于冰上超聲波粉碎機(jī)下將組織粉碎，勻漿于1 000 r/min，4℃，離心5 min，取上清即為蛋白提取物。采用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量。用蒸餾水將蛋白樣品調(diào)成相同濃度，加入相同體積上樣緩沖液，沸水煮10 min進(jìn)行蛋白變性。取50μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓110 V，90 min；電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，電壓80 V，1 h；脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗大鼠CDK2抗體和小鼠抗大鼠P27抗體（1∶1 000），4℃過(guò)夜；然后加入二抗室溫孵育2 h，BCIP/NBT顯色液顯色，約10 min，蒸餾水終止反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參.結(jié)果通過(guò)天能圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，CDK2蛋白含量=樣本CDK2蛋白灰度值/同一樣本β-actin灰度值，P27蛋白含量=樣本P27蛋白灰度值/同一樣本β-actin灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS14.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下各組肺組織纖維化評(píng)分比較

見(jiàn)表1。

2.2 免疫組化檢測(cè)各組肺組織CDK2及P27蛋白表達(dá)

見(jiàn)表 2，圖 1。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組肺組織CDK2及P27基因表達(dá)

見(jiàn)表 3，圖 2。

2.4 肺組織CDK2、P27基因表達(dá)與肺組織纖維化評(píng)分的相關(guān)性

高氧暴露下新生鼠肺組織CDK2基因的表達(dá)與纖維化評(píng)分呈正相關(guān)：（r=0.702，P<0.05）；P27 基因表達(dá)與纖維化評(píng)分呈負(fù)相關(guān)：（r=-0.765，P<0.05）。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肺組織纖維化評(píng)分（n，x±s）Tab.1 Lung fibrosis scores of control and experimental groups（n，x±s）

表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肺組織CDK2及P27蛋白表達(dá)的平均灰度值（x±s）Tab.2 Mean intensity of CDK2 and P27 protein of controland experimentalgroups（x ±s）

表3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肺組織CDK2、P27基因表達(dá)（x±s）Tab.3 Relative expression of CDK2 and P27 genes in control and experimental groups（x ±s）

2.5 Western blot蛋白定量分析

各組在33 kDa處和27 kDa處可見(jiàn)特異性蛋白條帶，對(duì)各條帶進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組變化均不明顯，實(shí)驗(yàn)組CDK2 3 d時(shí)與對(duì)照組無(wú)差異，7 d時(shí)表達(dá)升高，14 d 時(shí)明顯升高（0.51±0.05），與對(duì)照 14 d相比（0.39±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），21 d時(shí)達(dá)到高峰（0.64±0.08），與對(duì)照 21 d相比（0.40±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組 P27 3 d時(shí)與對(duì)照組無(wú)差異，7 d時(shí)表達(dá)開(kāi)始開(kāi)始降低，14 d時(shí)明顯降低（0.48±0.07），與對(duì)照 14 d相比（0.60±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），21 d時(shí)達(dá)到最低值（0.36±0.05），與對(duì)照 21 d相比（0.59±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 2）。

3 討論

盡管高氧致早產(chǎn)兒CLD的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，但其肺組織纖維化的最終病理結(jié)局已公認(rèn)，有關(guān)其纖維化的發(fā)生機(jī)制認(rèn)為與下列因素有關(guān)：（1）ECM合成及降解失衡，其中膠原的過(guò)度合成和沉積超過(guò)基質(zhì)蛋白酶的降解能力在CLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；（2）復(fù)雜的細(xì)胞作用，肺巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞及肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞是研究的熱點(diǎn)，其中肺成纖維細(xì)胞是公認(rèn)的纖維化發(fā)生的效應(yīng)細(xì)胞；（3）龐大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，其中研究最多的就是可促進(jìn)細(xì)胞增生和膠原蛋白合成的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）。特別是其下游更具特異性的促纖維化而不影響其他生物學(xué)活性的新靶點(diǎn)成為近年研究的熱點(diǎn)。

正常細(xì)胞增殖需經(jīng)歷G1、S、G2和M期4個(gè)時(shí)相，S期為DNA合成期，M期為有絲分裂期。期間存在多個(gè)檢控點(diǎn)調(diào)節(jié)各時(shí)相間的轉(zhuǎn)換。在所有檢控點(diǎn)中，尤以G1→S最為重要。它通過(guò)接受細(xì)胞周期蛋白構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)作用，發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控功能［3］。靜止期細(xì)胞處于G0期，受到生長(zhǎng)信號(hào)刺激進(jìn)入G1期，準(zhǔn)備DNA合成。此時(shí)，細(xì)胞周期蛋白（cyclin）表達(dá)上調(diào)，結(jié)合并激活相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK），二者的復(fù)合物使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，從而釋放出重要的核轉(zhuǎn)錄因子（E2F），引起一系列與S期有關(guān)靶分子的表達(dá)。通過(guò)G1晚期的限制點(diǎn)后，細(xì)胞進(jìn)入S期，此時(shí)發(fā)生復(fù)制。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin dependent kinaseinhibitor，CDKI）發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。

近年來(lái)，隨著細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的闡明，細(xì)胞周期調(diào)控因子在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用受到人們重視［4］。多種腫瘤組織及細(xì)胞內(nèi)均發(fā)現(xiàn)CDK2及P27的異常表達(dá)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌細(xì)胞中CDK2呈高表達(dá)，與對(duì)照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［6］。Sui等［7］研究發(fā)現(xiàn)，P27在卵巢癌中的表達(dá)較卵巢良性和良惡交界性腫瘤中減少。也有研究發(fā)現(xiàn)，CDK2的表達(dá)與垂體腺瘤的侵襲性呈正相關(guān)，而P27的表達(dá)與垂體腺瘤的侵襲性呈負(fù)相關(guān)［8］。靶向CDK2的siRNA能抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞增殖［9］。病毒載體介導(dǎo)的P27過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)體外腫瘤細(xì)胞周期停滯及凋亡［10］。

目前有關(guān)CDK2及P27異常表達(dá)對(duì)肺纖維化影響作用的研究報(bào)道較少。但有研究發(fā)現(xiàn)［11］，正常大鼠腎臟有P27表達(dá)，其對(duì)腎臟細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等有重要的調(diào)控作用，而在腎間質(zhì)纖維化大鼠模型中P27的表達(dá)與纖維化程度呈明顯負(fù)相關(guān)。血管平滑肌細(xì)胞異常增殖時(shí)CDK2蛋白表達(dá)上升［12］。說(shuō)明CDK2高表達(dá)及P27低表達(dá)均與纖維化密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)，高氧致CLD新生鼠中，對(duì)照組隨著日齡的增加，肺泡發(fā)育逐漸成熟，作為正常細(xì)胞周期活動(dòng)的必要蛋白，CDK2及P27在對(duì)照組中呈陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，CDK2蛋白和基因的表達(dá)呈逐漸上升的趨勢(shì)，14 d和21d時(shí)CDK2明顯高于同時(shí)間對(duì)照組（P<0.05），其基因表達(dá)與纖維化程度呈正相關(guān)；P27蛋白和基因的表達(dá)呈逐漸下降的趨勢(shì)。14 d和21 d時(shí)明顯低于對(duì)照組（P<0.05），其基因表達(dá)與纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化時(shí)CDK2基因表達(dá)增加［13］。用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）刺激體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞，細(xì)胞明顯增殖，且P27表達(dá)下調(diào)［14］。體外培養(yǎng)的特發(fā)性肺纖維化患者的成纖維細(xì)胞中，P27表達(dá)明顯低于正常人［15］。在本研究中，高氧后肺組織中CDK2表達(dá)上調(diào)及P27表達(dá)下調(diào)，提示細(xì)胞周期蛋白異常表達(dá)導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，這一機(jī)制可能在CLD肺纖維化發(fā)生中發(fā)揮極為重要的作用。在高氧致CLD中，TGF-β1是如何啟動(dòng)這一機(jī)制，而CDK2及P27又是如何發(fā)揮作用的有待進(jìn)一步深入研究。

［1］富建華，薛辛東.慢性肺疾病早產(chǎn)鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1基因和蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)及其對(duì)肺發(fā)育的抑制作用［J］.中華兒科雜志，2005，43（6）：463-465.

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