徐小燕，楊雪，夏蒲，邢亞楠，關(guān)一夫，鄭華川

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室；3.附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，沈陽(yáng)110001）

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的的重要性日益彰顯。在研究細(xì)胞不同組份的時(shí)候，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)這兩個(gè)細(xì)胞組份最受關(guān)注，這就要求研究者對(duì)細(xì)胞的核、質(zhì)蛋白進(jìn)行有效的分離提取，從而可以將分離出來(lái)的核蛋白用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，降低蛋白表達(dá)的背景噪聲，為蛋白功能研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［1］。本研究利用培養(yǎng)的癌細(xì)胞系，建立了一種比較經(jīng)濟(jì)、便捷的細(xì)胞核質(zhì)蛋白分離方法，約90 min就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白和質(zhì)蛋白的分離。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640、MEM、DMEM 和 Ham F12購(gòu)自海克隆生物化學(xué)制品有限公司，胎牛血清、青霉素和鏈霉素購(gòu)自 Thermo公司，一抗 Bag-1、GRP78、parafibromin、lamin B以及β-actin購(gòu)自Santa Cruz公司，抗ING5抗體購(gòu)自Proteintech公司，HRP連接的二抗IgG購(gòu)自DAKO公司，Thermo NE-PER誖Nuclear and Cytoplasmic Extraction試劑盒購(gòu)自 Thermo公司，Ambion PARISTM試劑盒購(gòu)自Ambion公司。胃癌細(xì) 胞 系 MKN28、MKN45、 KATOIII、HGC-27、GT-3TKB 和 AGS，肺癌細(xì)胞系 H-446、H-460、MS-1、PC14、AoI和SQ-5分別由神奈川癌中心高野康雄教授饋贈(zèng)。

RLN裂解液（配方來(lái)自Qiagen公司的RNeasy誖Mini試劑盒）的主要成分為50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、140 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L MgCl2和 0.5%Nonidet P-40（1.06 g/ml）。RIPA裂解液的主要成分為 50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、1% 脫氧膽酸鈉、0.1%SDS和1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。蛋白酶抑制劑的主要成分為苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、抑肽酶（aprotinin）、亮抑酶肽（leupeptin）和抑肽素（pepstain A）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

分別使用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素 、100 mg/L 鏈 霉 素 的 RPMI 1640（MKN28、MKN45、 KATOIII、H-446、H-460、MS-1 和 PC14)、MEM（HGC-27、AoI 和 SQ-5)、DMEM（GT-3TKB)和Ham F12（AGS)培養(yǎng)基在 37 ℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)癌細(xì)胞。

1.3 利用Ambion PARISTM試劑盒進(jìn)行核質(zhì)蛋白分離提取

收集1×107個(gè)新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞，用PBS洗1次，冰上放置。冰上預(yù)冷的100～500μl的細(xì)胞分離緩沖液重懸細(xì)胞，冰上靜置5～10 min。4℃條件下500 g離心樣品1～5 min，小心吸取胞質(zhì)成分。冰上預(yù)冷的細(xì)胞分離緩沖液清洗核沉淀。細(xì)胞破碎緩沖液裂解核沉淀后收集核蛋白。

1.4 利用 Thermo NE-PER誖Nuclear and Cytoplasmic Extraction試劑盒進(jìn)行蛋白提取

按照說(shuō)明書操作，收集細(xì)胞，PBS洗2遍，加入收集細(xì)胞10倍體積的細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑A，渦旋儀渦旋5 s，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)，冰上靜置10～15 min。加入細(xì)胞體積一半的細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑B，渦旋5 s，冰上靜置5 min，渦旋5 s，4℃條件下12 000~16 000 g離心5 min，立即吸取上清，抽提得到的即為細(xì)胞質(zhì)蛋白。完全吸盡殘余上清，向沉淀加入2.5倍體積的細(xì)胞核蛋白抽提試劑B，渦旋15～30 s，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)。然后放回冰浴中，每隔1～2 min再高速劇烈渦旋15～30 s，共30 min。4℃條件下15 000 g離心10 min，立即吸取上清，抽提得到的即為細(xì)胞核蛋白。

1.5 本實(shí)驗(yàn)室建立的核蛋白提取方法

收集2×107個(gè)細(xì)胞，用細(xì)胞體積3～4倍的RLN裂解液 （含 8.5%PMSF、0.1%Aprotinin、0.1%Leupeptin和0.035%Pepstain A蛋白酶抑制劑），冰上靜置20 min。4℃條件下3 000 g離心10 min，提取上清。加入原收集細(xì)胞4倍體積的RLN裂解液，吹打混勻，洗核沉淀。4℃條件下3 000 g離心10 min。徹底棄掉上清，加入RIPA裂解液100μl，在需要加入RIPA裂解液前數(shù)分鐘內(nèi)加入上述蛋白酶抑制劑。吹打混勻后，冰上靜置10 min。冰浴超聲工作5 s，間歇5 s，共3次。4℃條件下12 000 g離心20 min。提取上清即為所需的核蛋白。

1.6 Western blot

將收集的細(xì)胞按照上述3種方法提取胞質(zhì)蛋白和核蛋白后，采用Bradford法測(cè)定提取液中的蛋白濃度。各取50μg蛋白定量上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓110 V，150 mA電流半干轉(zhuǎn)膜120 min。用含5%脫脂奶粉的封閉液于室溫下?lián)u動(dòng)封閉1 h，分別加入一抗Bag-1（1∶500稀釋）、GRP78（1∶500稀釋）、ING5（1∶500稀釋）、parafibromin（1∶100 稀釋）、lamin B（1∶1 000稀釋）和β-actin（1∶1 000稀釋），4℃過(guò)夜。室溫下加入二抗（1∶5 000稀釋）孵育2 h。TBST洗膜，ECL法顯色，暗室中壓片、顯影、定影。

2 結(jié)果

利用Thermo的試劑盒提取核質(zhì)蛋白后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，在MKN28等5種胃癌細(xì)胞系中，36 kDa Bag-1存在于 MKN28、AGS、MKN45和 KATO-Ⅲ的胞質(zhì)中，32 kDa異構(gòu)體存在于HGC27細(xì)胞質(zhì)中，β-actin為質(zhì)蛋白檢測(cè)的內(nèi)參。雖然在AGS和HGC-27細(xì)胞核蛋白中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志性蛋白GRP78出現(xiàn)，但32 kDa和36 kDa異構(gòu)體在AGS細(xì)胞核中、50 kDa異構(gòu)體在HGC27細(xì)胞核中呈強(qiáng)表達(dá)。

利用Ambion的試劑盒提取核質(zhì)蛋白后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，在MKN28等5種胃癌細(xì)胞系中，ING5蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)。我們用質(zhì)蛋白內(nèi)參β-actin標(biāo)記核蛋白的污染程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在核內(nèi)表達(dá)極少。ING5蛋白在細(xì)胞質(zhì)里有少量表達(dá)，但是我們通過(guò)免疫組化方法已經(jīng)確認(rèn)了這種表達(dá)來(lái)自于核蛋白污染。

利用本實(shí)驗(yàn)室自建的方法提取核質(zhì)蛋白后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，在H-446等6種肺癌細(xì)胞系中，parafibromin主要是在6種肺癌細(xì)胞系的細(xì)胞核中表達(dá)。雖然PC-14和AoI兩種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有parafibromin表達(dá)，其表達(dá)水平與核蛋白內(nèi)參lamin B表達(dá)一致，提示可能是核蛋白污染所致。β-actin在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，在核成分中低表達(dá)，lamin B在胞核成分中高表達(dá)，在胞質(zhì)中低表達(dá)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室此次分離抽提的核質(zhì)蛋白較成功。

3 討論

本研究室自建的方法中，首先使用僅含有非離子表面活性劑Nonidet P-40的RLN裂解液，在不破碎核的前提下，通過(guò)破壞細(xì)胞膜釋放質(zhì)蛋白，然后使用含有陰離子表面活性劑SDS和脫氧膽酸鈉以及非離子型Triton X-100的強(qiáng)RIPA裂解液，配合超聲破碎核膜并粉碎DNA長(zhǎng)片段。為避免兩組分污染，吸取含胞質(zhì)成分的上清時(shí)不能劇烈過(guò)度抽吸，底部最好保留一些上清，然后把殘余的上清液輕輕抽取后棄掉并用RLN裂解液洗滌。此外，我們還可以通過(guò)RIPA裂解液的高離子強(qiáng)度和滲透壓來(lái)加速核膜破裂，提高核蛋白的提取率［2，3］。值得注意的是裂解液應(yīng)于4℃保存，使用時(shí)置于冰上并加入蛋白酶抑制劑。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在，提取超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。

內(nèi)參蛋白一般指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，選擇的內(nèi)參一般與檢測(cè)目的蛋白的分子量相差5 kDa以上。Western blot實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參檢測(cè)不但可校正蛋白質(zhì)定量和上樣過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)誤差，也可檢測(cè)Western blot操作系統(tǒng)是否正常。常用的細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參有：細(xì)胞骨架蛋白β-actin、β-tubulin和甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）；常用的核蛋白內(nèi)參有：組蛋白H（histone H）、核纖層蛋白（nuclear lamina protein）、K70、K80、Lamin A和B等［4，5］。本研究中選擇β-actin作為胞質(zhì)蛋白定量?jī)?nèi)參，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志性蛋白GRP78和β-actin作為細(xì)胞質(zhì)蛋白污染內(nèi)參［6］，Lamin B作為胞核蛋白定量和污染內(nèi)參。本研究結(jié)果顯示，利用Thermo試劑盒抽提的核蛋白中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志性蛋白GRP78出現(xiàn)，說(shuō)明有輕微的質(zhì)蛋白污染；利用Ambion試劑盒抽提的核蛋白中用胞質(zhì)蛋白的內(nèi)參β-actin的抗體檢測(cè)，β-actin的表達(dá)極低，說(shuō)明此次核質(zhì)蛋白分離的較成功，核蛋白中質(zhì)蛋白污染少；而分別在利用本研究室自建的方法抽提的細(xì)胞核蛋白和質(zhì)蛋白中使用胞質(zhì)蛋白內(nèi)參β-actin和胞核蛋白內(nèi)參Lamin B的抗體進(jìn)行檢測(cè)，胞質(zhì)蛋白中β-actin豐富表達(dá)，Lamin B微弱表達(dá)，胞核蛋白中Lamin B高表達(dá)，β-actin微弱表達(dá)。因此，可用胞核蛋白內(nèi)參檢測(cè)胞質(zhì)蛋白中是否混入細(xì)胞核組分，可用質(zhì)蛋白內(nèi)參檢測(cè)胞核蛋白中是否污染。

本研究室自建的方法與試劑盒相比，操作方法簡(jiǎn)單，僅需自行配置RLN和RIPA兩種裂解液，各成分均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的試劑，而且價(jià)格僅是試劑盒價(jià)格的百分之一，裂解液配制后冷藏存放，可隨取隨用，為實(shí)驗(yàn)節(jié)省大量開(kāi)支，具有在實(shí)驗(yàn)室中推廣使用的價(jià)值。

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